在当前的临床环境中，外分泌系统中货物蛋白的分析至关重要，但临床应用中如何获取多个外分泌系统仍存在诸多限制。本文介绍了一种灵活、快速、低密度的外分泌体递送方法。该方法利用交变磁场促进抗包膜磁珠（MBs）与血清进行三维分离，并采用微电流和中等动态混合。通过对磁珠进行过度磁振荡，在30分钟内，仅需50μL原始血清，即可实现超纯外分泌体的实际捕获效率超过70%。该方法用于抗L1CAM抗体治疗的外分泌体物理免疫捕获，经标准电泳ELISA组进展α-突触核蛋白（α-syn）含量分析后，按类别进行实际测量，可获得特异性差异，约75分钟即可获得原始结果。该方法具有高性能和半自动的特点，具有良好的应用前景，可为金森病的诊断提供支持，并在外分泌生物标本的分析中具有普遍优势。
引用
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外分泌体由存在于人体生物系统中的30-150个细胞外泡沫型细胞分泌。因此，细胞的内在生成，以及它代表细胞状态的事实，与生物标本的存在相平行。它们携带1个序列报告母细胞来源的日本遗传物质，脂质总蛋白。天然外分泌体（原始外分泌体）可能位于世界的中心，而原始病理生理状态可以通过生物替代生物标本来确定。此前，我们已在患有金森病（PD）或高频眼动睡眠行为障碍的患者中检测到分离的L1CAM阳性，以及分离的L1CAM阳性外分泌介导的α-突触核蛋白（α-syn）含量。
金森氏病的病理基础是α-突触核蛋白（α-syn）。然而，尽管金森氏病的发病率在全球范围内并未增加，但确诊时患者通常已出现临床并发症，且病理进展与疾病发展同步。外分泌α-syn可提供用于早期诊断的生物样本，可用于预防疾病的退行性发展，避免疾病的过早治疗，从而减缓疾病进展，提高患者的生活质量。本文主要探讨了以下几个方面：目前外分泌体α-syn的高灵敏度检测方法、对一种健康的外分泌分离方法的需求、现有操作的局限性以及天然存在的差异，以及高选择性和高灵敏度检测方法的理想状态。
外泌體分離的常用方法基於差速離心、尺寸排阻和聚合物沉澱。 這些方法特異性低（同時富集細胞和細胞碎片）、勞動強度大，且通常需要數百微升患者血液。 基於特定表面標記表達（如L1CAM）的外泌體亞群免疫親和分離在色譜或微流控分離中的固體支援物上應用有效，但這些方法可能存在捕獲率低和/或需要生成高表面積納米結構支援物（固體柱或孔隙）的問題。 分散的抗體包被磁珠（MBs）在溶液相中的應用已成為外泌體分離越來越受歡迎和可訪問的方法，但通常需要4-16小時的孵育，有時還需要額外的連續攪拌，以最大化免疫捕獲。 已有多種嘗試改進MB混合動力學和相關捕獲動力學（可能在約1小時內從約100μL樣本中分離），例如通過使用微混合器或納米結構微流控通道，但這些方法都需要複雜的工程（納米級通道或納米結構表面）和二次（離線）磁分離步驟。 標準MB基外泌體提取通常利用在化學簡單介面上建立的穩健抗體偶聯，儘管這可以支援高（70-90%）捕獲效率，但通常與廣泛的動手動樣本處理和洗滌相關。 先前提出的半自動晶元外泌體分離方法作為手動MB提取的替代方案，減少了勞動、時間和交叉污染風險。 然而，此類方法與相對較低的捕獲率（<70%）相關，只能實際應用於外泌體高表達的真實樣本分析。 大多數此類方法還採用具有簡單表面化學的MBs，無法防止非特異性吸附蛋白質、核酸或其他雜質，對下游分析可能產生顯著影響。 如果要從真實樣本中實現清潔提取，則需要更複雜的MB塗層。
本文中，我們試圖通過使用現成的電磁鐵產生的交變（AC）磁場來控制磁免疫顆粒的集體運動，這些電磁鐵跨越簡單列印的微流控通道; 我們觀察到這促進了在幾十分鐘內達到的捕獲效率，這通常（否則）需要數小時才能實現。 磁場切換還促進受控的原位外泌體洗滌和裂解（方案1A），隨後對可棄式32多電極陣列上的雙標記α-syn和syntenin-1（synt-1）進行電化學定量（方案1B）。 整個方法通過對72個患者樣本的分析得到驗證，神經元（L1CAM+）外泌體中的α-syn表達與PD狀態之間存在明顯的統計相關性。 通過參考L1CAM+外泌體的手動分離和多羧基甜菜鹼甲基丙烯酸酯（pCMBA）包被免疫珠過夜孵育后獲得的商業電化學發光測定（MSD），進一步驗證了解析的標記水準。
實驗部分
磁性納米粒子合成
將700納米二氧化矽包被的超順磁珠（Cytiva）在5 mL乙醇/水（1：1 v/v）中以10 mg/mL濃度，與100 μL （3-氨基丙基）三乙氧基矽烷（APTES）和100 μL四乙氧基矽烷（TEOS）在冰浴中反應1小時，形成APTES修飾的MBs。 將740 nm APTES-MBs從反應溶液中用磁鐵提取，用水洗滌三次，用乙醇洗滌三次，然後在真空下乾燥; 將10 mg/mL APTES-MBs（在水中）與100 μL環氧氯丙烷（在冰浴中反應1小時）和100 μL四乙烯五胺功能化，洗滌後與鏈轉移劑（CTA）（雙（羧甲基）三硫代碳酸酯（BCTTC））（38 mg溶於乙醇/水（1：1 v/v））一起孵育。 顆粒通過磁分離，用50% v/v乙醇/水洗滌，重新懸浮在乙醇/水（1：1 v/v）中，與BCTTC（3.7 mg）、4,4′-偶氮雙（4-氰基戊酸）（ACVA）（10 mg）和羧基甜菜鹼甲基丙烯酸酯（CBMA）（38 mg）的混合物一起过夜孵育。 孵育后，顆粒用水洗滌三次，用乙醇洗滌三次，在真空下乾燥，並在4°C下儲存。 將顆粒重新懸浮在水中，濃度為2 mg/mL，使用EDC/NHSS激活遊離羧基30分鐘，洗滌后與抗體在室溫下孵育3小時。 聚合物薄膜厚度（約20 nm）和低電荷（≈-5 mV）符合預期。 抗體覆蓋率為≈4.77 μg/mg顆粒，代表81%的理論單層表面覆蓋率。 這些顆粒隨後表現出極低的蛋白質非特異性吸附，由電化學定量吸附蛋白質的低背景表明。
外泌體分離
使用雙注射泵獨立控制樣本和MB注入。 首先以20 μL/min的速度將50 μL PBS中的MBs（濃度為2 mg/mL，相當於100 μg MBs）引入微流控晶片。 通過向左側磁鐵施加12 V電位，啟動永久模式磁場，將MBs保持在混合室中。 然後以20 μL/min的速度將50 μL樣本泵
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入混合室，在永久磁場下進行。 一旦樣本填滿混合室（90秒），停止流動，將磁場切換到優化頻率的交變模式，使用可程式設計Arduino晶元和可調能源供應。 混合30分鐘后，將磁場切換到永久模式，通過以50 μL/min（4分鐘）流動PBS-T20 200 μL清洗MBs。 清洗后，以50 μL/min的速度將50 μL裂解緩衝液泵入混合室，使其在交流模式下與MBs（攜帶捕獲的外泌體）一起孵育，以允許外泌體裂解。 然後將裂解物（50 μL）轉移到收集管中，並用PBS稀釋4倍進行電化學分析。 對於不進行裂解的外泌體提取，遵循上述相同的提取程式，並在不裂解的情況下將捕獲外泌體的MBs轉移到收集管中。 MSD分析的外泌體提取使用相同的MBs，在4°C下與250 μL血清樣本在低結合管（Eppendorf）中過夜孵育，同時進行連續攪拌。 MBs被收集，用PBS-T20通過永久磁鐵洗滌3次，然後與裂解緩衝液孵育15分鐘，再使用標準MSD協定對α-syn和synt-1進行定量（見SI中的“材料和方法”）。
電化學分析
开发了一种用于电化学分析的多电极（32电极）阵列，采用标准ELISA方法同时分析10种不同种类的蛋白质。将抗α-突触核蛋白（人α-突触核蛋白双联ELISA试剂盒（货号：DY1338-05），R&D Systems公司，美国）或抗突触核蛋白-1（Travel Abcam公司，货号：EPR8102；Invitrogen公司，货号：PA5-28813）以主要浓度包被在电极上。将阵列（32电极）用于分析α-突触核蛋白或突触核蛋白-1，每个电极阵列包含10个重复样本，另有6个标准浓度用于同时操作（用于电化学校准）。每个电极与50 μL样本染色体15分钟，用100 μL PBS-T20洗涤两次，与生物素化（抗α-syn来自Human alpha-Synuclein DuoSet ELISA（Cat# DY1338-05），R&D Systems，USA，以及抗synt-1来自Novus Biologicals，Cat# K10P3D5）双重抗磨10分钟孵育钟， 100 µL PBS-T20 洗涤，50 µL HRP 孵育 10 分钟。最后，清洗电极后，进行TMB（TMB）孵育方法2分钟。用水冲洗后，使用 SWV 方法（0.0-0.5 V vs Ag/AgCl），电压步长 2 mV，幅度 20 mV，频率 25 Hz。校准曲线通过标准重蛋白浓度，并建立了SWV峰高相关性。针对患者模型，遵循相同的序列，同时使用八孔/板渐进式电学科学校对（实际校准器）。之后，我们使用一系列标准蛋白质采集校准数据来测量每个个体中心α-突触核蛋白和突触核蛋白-1的浓度（基于每个个体系列测量的标准渐进式校准）。使用32电极阵列实际上实现了高流速分析，但使用电化学分析是小流速控制和外部分泌体分离的集合。
结果与讨论
磁珠合成材料盖
使用前，采用导向法合成CBMA并包覆MBs，同时进行少量改性。在MBs上形成700 nm双层包覆层（磁芯/双层金属壳），并在MBs表面包覆20 (±11) nm的APTES/TEOS复合层。由此，BCTTC和CTA的生成财富得以固定。之后，将颗粒和CBMA材料与CTA复合沉积（ACVA）混合，形成15 (± 7) nm的pCBMA包覆层（见SI中间图S2；详细合成方法见“材料合成方法”）。天然阴离子颗粒的zeta电位为（-17±3 mV），改性后为+22 (±4 mV)，最终值为-4 (±1 mV)（见SI中间图S2B）。抗体加载后，我们测得 MB 的浓度为 4.8 μg/mg（≈7.0×10^4 抗体/颗粒），采用 BCA 法测定蛋白质含量（参见“物质总和法”），理论层表面覆盖率通常大于 80%。在人血清白蛋白孵育 1 小时后，生成颗粒过量（10 mg/mL），但其蛋白质摄取量无法测量（BCA 法测量限低 (<0.2 μg/mL)）（参见“材料与方法”）。对 MB 的非回流特性进行电学分析（图 2E、F）以及对大荧光进行显微测量（参见 SI 中间图 S2 和 S3；“物质总和法”；“免疫荧光测量”）。Shinichi 来访。裸露的 pCBMA MB 的蛋白质特征 (WB) 分析还表明，在分解液中过夜孵育后，发现胞外分泌体特异性蛋白 L1CAM 和 CD81（见 SI 中间图 S2）具有免疫特异性。
微电流外分泌分离
我们的设计与3D柱标记平行，采用一个Y型混合微流控装置，安装在主免疫MB注射入口处，方向为圆柱形混合室，直径1.5 mm，体积50 μL（方法1A和SI中间图S1）。使用前，将50 μL混合室涂覆1%牛血清白蛋白（BSA）PBS溶液，以降低非特异性血清蛋白在柱表面的吸附，但仍保留部分非特异性血清蛋白吸附。V）电源。使用抗CD9或抗L1CAM抗体的抗MB，其中CD9阳性外分泌体（通常约占血清外分泌体的75-85%）或L1CAM阳性外分泌体（占总外分泌体的8-13%）。
振动势和频率的总和决定了物理力的流动、混合物的总和以及各个独立控制的控制；改变混合时间也会产生影响，30分钟的孵化支持可提供约70-75%的效率（见1C）；相对较短的孵育时间导致捕获效率较低，但相对较长的孵育时间和非诱导显著提高了捕获效率。为了捕获外部分泌物和其他血清成分，可以将磁场改为永久模式，并在流动洗涤缓冲液（硫酸缓冲液-0.05% Tween 20 (PBS-T20)）下捕获磁珠（及其载荷）。洗涤后，使用裂解缓冲液（含1% Triton X-100）进行裂解。
在相似的流速总孵育时间（第30次孵育，流速2 μL/min）下，比较了交流磁场促进的外分泌系统递送效率和均匀微电流布置下以及无交流磁场条件下的实际效率进展。NTA分析（参见SI中的“物质总和法”）表明，L1CAM+或CD9+外分泌分离效率>70%（在NanoSight NS300的操作动态范围内，很少在内部范围内），并且在30分钟孵化期间的捕获效率<20%（图1D）。
电气化分析
建立了α-突触核蛋白和突触核蛋白-1（同类型双抗原同时分析）检测方法，采用标准心电图ELISA形式，并行推进。综合参考手册（15分钟计时）、生物雾化测量电阻体（Ab2）（10分钟计时）、钬靴性性质-辣根郁性层（St-HRP）（10分钟计时）和和沉沱TMB（2分钟计时）依次孵育。HRP活化在电极表面产生局部浓度，TMB过滤取决于局部浓度以及可通过的SWV峰值电流。用于打印32电极阵列和无底32孔ELISA板（见SI中间图S4），α-突触核蛋白和突触核蛋白-1阵列间标准差<20%，阵列内电极间标准差<12%（见SI中间图S5）。每个孔代表一个独立的电极组，包括检测电极、计算电极和连续接触式多电位计的电极组。每个板分为两部分：16 个孔用于 α-突触核蛋白 (α-syn) 检测，16 个孔用于突触核蛋白-1 (synt-1) 检测，另有 8 个孔可用于抗原分析。在实际分析之前，我们使用标准重链 α-syn 和突触核蛋白-1（以 1% BSA 代替人工蛋白 Fengfu 底物）进行组蛋白制备。检测要求为 50 μL/孔，检测时间 <40 分钟，检测限为 200 fg/mL，α-syn 检测限为 3.2 ng/mL，synt-1 检测限为 0.25-5000 pg/mL，synt-1 检测限为 16-1600 ng/mL（图 2A、B）。在高浓度（临床相关）的人血清蛋白（BSA；人血清白蛋白（HSA）；纤维蛋白；皮肤红蛋白）中，测量选择性极佳（图 2C 和 D）。
