体内循环通过蛋白质降解和修复进行，由细胞间通讯和外分泌介导，从而维持细胞形态。跨膜蛋白LAMP2A在外分泌过程中被选择性货物包裹，并存在eLLoC。本研究利用人视网膜色素上皮细胞分析其内部和外分泌组成，并研究了LAMP2A如何影响其内部蛋白质组成和功能。LAMP2A已被敲除并转化为Rab GTP，其相对于皮质皮肤蛋白的表达降低，并经过修饰以改善其内部氧化和成熟。蛋白质ExoSignals（包含ExoSignals）的丢失、LAMP2A的表达及其内部特征的形成。实际上，LAMP2A的完善是由于内部命运方程的设计以及外部分泌对机体的共同影响。因此，LAMP2A具有协同膜特性、内部成熟、外部分泌和细胞间通讯的功能。
引用
内膜细胞穿过内膜系统时，其内部膜隔室组成发生变化。早期内体（EE）、晚期内体（LE）和最终内体的动态变化。在此过程中，反式高尔基网络（TGN）为内体的成熟提供了关键蛋白。此外，还存在限制内膜的内膜形成腔内泡（ILV）以及可用于限制膜通过内体的内部分离复合物（ESCRT），从而导致CD63、syntenin-1和其他替代分子群介导的非ESCRT机制。当泡沫的内部膜融合在一起时，促进机制的蛋白质和脂质被轴向降解；当泡沫的内部膜融合在一起时，外分泌体形成。
我们近期的研究团队发现了一种非ESCRT机制，称为“外分泌LAMP2A负载货物”（eLLoC），该机制可用于选择性地将蛋白质送入外分泌系统。LAMP2A是一种体内横膜蛋白，在ILV形成过程中位于体内膜上，并能与ILV中的特定信号分子（外泌信号）结合。值得注意的是，尽管我们目前仍在开发LAMP2A，但LAMP2A本身却蕴含着丰富的信息。另一方面，对LAMP2A敲除（KO）细胞的中外分泌系统定性（MS）分析表明，外分泌成分随时间发生了变化，包括外泌信号蛋白的丢失，并且eLLoC机制也发生了初步改变，导致了意想不到的分子变化。
Tameshin研究的第一步，我是LAMP2A KO的内部路线组， 香港龙城大学所有产品， 香港龙城大学必买产品， 香港龙城中西大学， 香港龙城大学Line 购买，香港龙城大学商店， 香港龙城 大学百货商店信息，香港 龙城 大学百货商店配送方式进展，MS分析。我们采用细胞分类和分离技术测定了EE和LE的外分泌物和蛋白质含量。针对LAMP2A，我们提供了一种综合方法，该方法在胞外分泌生物学发育过程中具有高度时空分析能力，并阐明了非常清晰的eLLoC分子机制。LAMP2A KO表现出内部皮质蛋白释放增加、可塑性机制增强以及内部皮质蛋白含量降低。 LAMP2A 的敲除效应导致了 Rab GTP 的存在，Rab GTP 也是一种系统性蛋白，特别是 4,5-二氧杂环己酸 (PI(4,5)P2)，它是一种胞内分泌蛋白，并在成熟过程中发生变化。此外，质谱性能分析的关键性也得到了证实。本发明提供了关于 LAMP2A 胞内动态及其对细胞间通讯和蛋白质降解影响的关键新内容。
结果
内部特征
我們使用不連續蔗糖梯度分離了內體區室。 使用這種方法，可以獲得兩個組分，一個富含EE標記物EEA1，另一個富含LE標記物Rab7。 這些組分缺乏線粒體標記物TOMM20和溶酶體標記物組織蛋白酶B。 當使用透射電子顯微鏡（TEM）比較這兩個組分時，圖像顯示Rab7豐富的區室在其限制膜內有更多的ILVs，這與該組分代表較晚的內體區室一致。
對內體組分進行的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）用於進一步表徵組分的蛋白質含量。 數據顯示，LAMP2A亞型僅在野生型細胞的所有組分中被鑒定出來。 代表三個生物重複的威恩圖顯示，所有組分之間共享超過2700種蛋白質，代表至少94%的所有已鑒定蛋白質。 主成分分析顯示同一樣本組分之間的變異性較低，這證實了重複的相似性。 此外，觀察到小細胞外囊泡（sEVs）、EE和LE組分沿PC1的清晰聚類，表明每個組分具有獨特的蛋白質組譜型。 對於sEVs中LAMP2A KO后顯著調控的蛋白質（p < 0.05），有302種下調蛋白質和322種上調蛋白質; 在EE中有224種下調蛋白質和165種上調蛋白質; 在LE中有251種下調蛋白質和327種上調蛋白質。 內體組分中一些調控的蛋白質通過Western blot得到確認。 在下調的蛋白質中，sEVs、EE和LE分別有66.34%、68.89%和71.03%含有至少一個ExoSignal（五肽基序）。 數據分析還顯示，在調控的蛋白質中，sEVs和EE之間有67種共同蛋白質，sEVs和LE之間有88種，EE和LE之間有79種，而所有區室之間僅有18種是共同的。 此外，主成分分析（PCA）數據顯示EE組分和LE組分最為相似，而LE受LAMP2A KO的影響最大。
LAMP2A KO对小细胞外囊泡和内吞途径相关内体区室的功能影响
為了探索LAMP2A KO對sEVs和內吞途徑相關內體區室的功能影響，我們使用基因本體論（GO分子功能、GO生物過程、GO細胞組分）和KEGG通路資料庫對LAMP2A KO后上調和下調的蛋白質進行了詳細的富集分析。
GO分子功能分析顯示，在sEVs中，下調的蛋白質在PDZ結構域結合（GO：0030165）方面表現出顯著富集，已知該結構域將膜蛋白錨定到細胞骨架並與其相互作用。 此外，sEVs中下調的蛋白質在磷脂醯肌醇結合（GO：0043325）方面富集。 在LE中，KEGG分析顯示磷脂醯肌醇信號蛋白顯著富集，特別是與PI（4,5）P2相關的蛋白質，這進一步表明LAMP2A KO后PI（4,5）P2受到強烈調控。
GO分子功能分析還揭示了Rab GTP酶和Rab相關蛋白質在sEVs中的顯著富集。 Rab蛋白是囊泡形成、運動和融合的核心調節因數，通常與磷脂醯肌醇協同作用以建立膜特性並指導囊泡運輸。 其中，Rab27亞型在LAMP2A KO后表現出不同的模式：Rab27b在EE中上調，而Rab27a下調。 鑒於Rab27b與外泌體釋放密切相關，這種亞型轉換與內體命運的轉變一致。 同時，我們還觀察到EE和LE中與肌球蛋白結合的蛋白質富集。 肌球蛋白是基於肌動蛋白的馬達蛋白，介導內體運輸和囊泡融合事件。 特別是，肌球蛋白V家族成員以其將內體拴在質膜上的作用而聞名。 Rab-肌球蛋白的相互作用提供了一個機制框架，其中Rab重塑直接與驅動囊泡定位和胞吐作用的細胞骨架馬達耦合。
GO生物過程分析顯示，sEVs下調的蛋白質在多囊泡體蛋白質和神經醯胺生物合成過程調節方面富集，神經醯胺參與內體膜上的ILVs出芽。 關於上調的蛋白質，EE在與胞吐作用相關的眾多術語方面富集。 此外，與高爾基體相關的蛋白質僅在sEVs中上調，而與TOR信號相關的蛋白質僅在LE中上調。
在KEGG通路分析中，除了LE中磷脂醯肌醇信號系統的上調外，LAMP2A KO還導致sEVs組分中與mTOR信號通路相關的蛋白質下調。 在LE中，下調的蛋白質與肌動蛋白細胞骨架的調節相關聯。
GO細胞組分分析顯示與肌動蛋白細胞骨架相關的蛋白質在所有組分中均上調。 有趣的是，與肌動蛋白細胞骨架通路調節相關的另一組蛋白質也下調。
使用ClueGO分析顯示，LAMP2A的KO導致調控的蛋白質聚類在肌動蛋白細胞骨架（在所有組分中上調）、Rab GTP酶和磷脂醯肌醇（在sEVs和LE中上調）、內溶酶體（在EE和LE中上調）和囊泡分泌（在EE和LE中上調而在sEVs中下調）以及神經醯胺（在sEVs中下調）等群組中。
總的來說，我們的研究結果表明LAMP2A缺失在內體區室和sEVs中誘導了協調但不同的變化。 在EE中，我們觀察到Rab重塑（從Rab27A到Rab27B）、皮質肌動蛋白拴系的喪失以及偏向於胞吐作用的磷脂醯肌醇組成的轉變。 LE顯示出Rab7、v-ATPase/LAMTOR和溶酶體酶的增加，與增強的酸化和成熟一致。 最後，sEVs富含Rab GTP酶、肌球蛋白結合蛋白和肌動蛋白相關因數，反映了膜和貨物組分的選擇性分區。 這些數據表明LAMP2A可以影響內體特性，將內體命運從分泌轉變為降解，從而將蛋白質組特徵與內吞途徑中的功能後果聯繫起來。
LAMP2A KO細胞內體內體區室術語富集分析的實驗驗證
為進一步確認LC-MS/MS數據分析的功能影響並評估LAMP2A KO對內體的影響，我們從野生型、LAMP2A KO和LAMP2A拯救細胞中分離了這些亞細胞區室。 LAMP2A拯救細胞顯示出與野生型無法區分的LAMP2A定位以及CD63和EEA1分佈。 Western blot分析顯示，LAMP2A KO導致Rab27a水準下降，而Rab27b水準上升。 LC-MS/MS數據最初強調的這種Rab27亞型的差異變化在我們的實驗中得到證實。 此外，我們觀察到包括Rab3、Rab7、Rab8和Rab35在內的其他幾種Rab蛋白水準升高，與我們之前的發現一致。 重要的是，在KO細胞中恢復LAMP2A的表達將所有Rab蛋白的水準恢復到野生型水準。
此外，LAMP2A KO細胞的內體組分顯示出肌動蛋白水準降低。 從內體富集組分中進行的肌動蛋白免疫沉澱進一步顯示與內體的共沉澱減少，如內體標記物CD63水準降低所證明。 使用胰蛋白酶孵育分離的內體進行女士催情藥 延時噴霧劑 性用品周邊 治療性冷感 淫蕩春藥水 男士催情藥 男士助勃藥 男士持久藥 補腎壯陽藥 迷昏失憶型 陰莖增大丸
的蛋白酶抗性測定顯示，雖然EEA1和Rab7部分受到保護，但肌動蛋白幾乎無法檢測到，表明其定位僅限於內體限制膜。 肌動蛋白絲的鬼筆環肽標記顯示與內體標記物CD63和EEA1的共定位減少，LAMP2A拯救后這一缺陷得到恢復。
为了进行评估，我们将LAMP2A敲除细胞溶解于氧化组织蛋白D活性溶液中，并使用pH敏感探针作为组织蛋白D活性染料。LAMP2A敲除可增加pH诱导的组织蛋白D活性（表明存在荧光），同时管腔内pH值降低，组织蛋白D活性升高。此外，酸性区域和活性区域的数量也增加。LAMP2A表面修复可使pH值和组织蛋白D活性恢复至野生型水平。
在监测细胞中，PI(4,5)P2 水平表达，PI(4,5)P2 与 RFP 融合蛋白结合，PI4P 和 GFP 标记的探针也进行了标记。之后，我检测了探针，并与细胞内标记物 CD63 进行了共定位。结果显示，LAMP2A 敲除后，PI(4,5)P2 探针表达降低并与其共定位，同时 PI4P 探针表达升高并与 CD63 共定位。同样，LAMP2A 保留后也观察到了相同的现象。
因此，LAMP2A蛋白含量降低，内部Rab蛋白组发生显著变化，内部体和膜的分泌过程减少，内部体在成熟过程中增加。液晶酸度及液相动力学和液晶性的实际变化结果得到了验证，并为LC-MS/MS分析提供了观察支持。
