细胞外囊泡（EVs）是细胞间重要的通讯方式，在疾病早期治疗方面具有巨大潜力。如果血液等生物体液中存在EVs，则可采用多种治疗方法。然而，目前患者数量有限。一旦我们了解了这一问题，就可以进一步深入研究疾病机制，研究人员也将开始利用体外细胞培养模型进行基于EVs的分子差异探索和高通量分析。自两种细胞培养技术和生物学研究工具发展至今已有十年，并涌现出多种生理相容的体外工具。然而，目前尚缺乏对三种材料培养过程中EVs产生进展的比较分析研究。本文最后全面介绍了主要研究成果、三维双细胞培养模型、EVs的产生、产品特性及性能影响。
2. 双细胞组合与三细胞培养材料收集的比较
下面列出的是各个部分：3D细胞培养模型（1个绿色框架）、末端无支撑球形模型、支撑方法、逐步水冷冷凝过程和独立支撑生物反应器系统。
2.1 独立三细胞模型：球体
2.1.1 低吸收培养皿 日本培养皿
低吸附（也称无吸附）培养板可防止细胞黏附于表面，促进三细胞球的形成。这类小型培养板通常含有水性化合物，如HEMA，蛋白质含量较低。低吸附培养容器的主要优点是：分布均匀、密度低、使用方便、促进细胞黏附、印度本土分布、 无 副作用、具有植物生长能力、提高天然草药生长率 、排泄迅速，以及 男性口服培养产品。承载能力差， 需要长期治疗。 功能性 保健食品产品名称： 中年男性健康精选 ，特殊内部设计。然而，实际操作方法通常有所不同，但可以引入更多动力和引导作用。有限空间内可能的聚集会导致引导细胞死亡。此外，我们还提供了一种紧凑型模型，该模型具有弱支撑模型、外部培养基材料 (ECM) 和可用于培养生物反应器的生物反应器，以及一种对生理条件敏感的先进 3D 培养系统。
2.1.1.1 无壁微孔板
本研究采用超低粘度（ULA）技术在96孔板中培养PANC-1腺癌细胞，形成三维球体；同时，采用细胞外液（EV）技术在24孔板中培养细胞，形成二维球体。培养期间，将液体置于培养床上，24小时后形成球体。24小时后，收集球体。第5天，收集各种模型培养基（培养基中添加10%胎牛血清（FBS）），分离细胞外液，并送至商业实验室进行检测，共获得220份外部细胞培养样本。
透射电子显微镜（TEM）显示，EV主要分布在40至150纳米之间，但未评估2D和3D条件下尺寸分布的差异。 TEM和RNA选择性染色萤光成像均显示，3D球状体分泌的EV显著更多（图2A）。 定量即时PCR（qRT-PCR）分析了2D细胞、3D球状体及其相应外泌体中的六种特定miRNA（图2B）。 外泌体中的miRNA表达始终高于亲代细胞。 在外泌体miRNA中，miR-96在2D和3D培养之间没有显著差异，miR-4454在3D衍生的外泌体中显著较低，而miR-1246、miR-21、miR-17-5p和miR-196a在3D衍生的外泌体中显著富集。 通过总外泌体RNA和蛋白质分离试剂盒提取并量化外泌体和亲代细胞中的蛋白质，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量Glypican-1（GPC-1）水准。 来自3D球状体的外泌体表现出GPC-1水准增加了4倍，高于2D培养的外泌体及2D和3D亲代细胞，表明3D培养环境可能增强外泌体分选机制（P < 0.001）（图2C）。
總體而言，這種3D無支架培養生成的球狀體分泌了更多的EV，富含特定的基因組和蛋白質組貨物，為理解疾病機制和途徑提供了寶貴的見解。 支援非貼壁96孔板增加EV產量的研究發現，將骨髓間充質幹細胞（BM-MSCs）培養在塗有聚-HEMA的96孔板上，到第5天時EV產量比2D培養增加了兩倍以上（p < 0.001）。
相比之下，一項比較BM-MSCs在非貼壁96孔板中2D和3D培養的研究發現，3D模型並未增強EV的產量、形態或貨物。 EV在這兩種條件下相當，2D衍生的EV顯示出更高的蛋白質多樣性。 有趣的是，3D衍生的EV表現出促炎和促纖維化作用，表明其治療潛力降低。 缺乏EV增強可能是由於在接種細胞后僅24小時就切換到無血清培養基，這可能限制了球狀體的成熟。 此外，高細胞接種密度（每孔2.5 × 10⁴個細胞）可能損害了球狀體內部的營養和氧氣擴散，減少了深部球狀體細胞的存活率和EV分泌。
2.1.2 懸滴法
懸滴法涉及將小滴細胞懸液倒置放置在蓋子或平面上，利用重力和表面張力促進細胞聚集和球狀體形成。 通過對液滴體積和細胞密度的調整，可以精確控制球狀體大小，實現均勻聚集體的可重複形成。 該技術成本低廉，無需特殊設備，適合中等通量應用。 然而，它缺乏ECM成分和動態培養條件，可能會限制生理相關性。 此外，培養基更換技術上具有挑戰性且勞動密集，使其不適合長期或大規模研究。
評估了BM-MSCs在3D懸滴（HD）培養系統與單層培養瓶中產生的EV差異。 BM-MSCs在含有10%去除外泌體FBS的培養基中生長，使用沉澱法分離外泌體。 通過Nanodrop儀器測量外泌體蛋白濃度並歸一化到1 × 10⁵個細胞來量化外泌體分泌。 第5天細胞培養時，3D HD細胞每個細胞分泌的外泌體顯著多於2D培養的細胞，增加了兩倍（p < 0.01）。 雖然不同培養條件下的外泌體產量存在顯著差異，但未評估其他EV特性。
2.2 基於支架的3D模型：水凝膠
水凝膠是能夠保留水分並類比ECM的交聯聚合物網路，提供結構支援、生化信號和受控品質傳輸，與依賴細胞間相互作用的無支架模型不同。 它們的成本低、製造容易，並且材料組成靈活，包括天然（如膠原蛋白、藻酸鹽）和合成（如PEG、PAA）聚合物，使其廣泛應用於體外模型。 水凝膠可以通過調整交聯密度、pH值和溫度等參數來調節硬度、孔隙率和降解速率，從而適應不同的組織類型。 它們還支援可溶性因數的擴散以促進細胞生長。 然而，缺點包括機械強度有限、難以實現均勻孔徑以及不適合承重組織。
2.2.1 膠原蛋白
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基於膠原蛋白的水凝膠因生物相容性、生物降解性和類比天然ECM的能力而在癌症和組織工程模型中得到廣泛應用。 作為主要的ECM蛋白，膠原蛋白通過細胞-基質相互作用支持細胞粘附、遷移和信號傳導，特別適用於建模腫瘤微環境。 其機械性能、孔隙率和纖維密度可以通過調整濃度、pH值、溫度和離子強度等參數進行調節。 然而，作為一種動物來源的天然材料，膠原蛋白存在批次變異性、病原體傳播風險的隱患，其有限的硬度和穩定性可能限制其在長期或承重應用中的使用。 為了模擬腫瘤ECM，一項研究使用膠原-透明質酸（Col1-HA）支架培養尤文肉瘤（ES）細胞，並將這種3D組織工程（TE）模型產生的外泌體與2D Col1-HA塗層板、聚丙烯管中3D球狀體和患者血漿產生的外泌體進行了比較。 細胞培養7天，第3天和第7天收集培養基以分離外泌體。
NTA顯示，Col1-HA支架中的外泌體分佈更密集且尺寸更小，類似於患者血漿衍生的外泌體（圖4A）。 平均外泌體模式尺寸分別為103.3 nm（2D培養）、76.7 nm（Col1-HA支架）和70 nm（人血漿），表明3D結構、支架組成或兩者共同影響外泌體尺寸。 進一步與聚丙烯中的3D球狀體和基質塗層板上的單層培養進行比較，發現這兩個系統均未能複製天然外泌體尺寸，強調了3D架構和基質組成對於類比生理外泌體特性的必要性。
該研究檢查了外泌體貨物差異，重點關注Polycomb組蛋白甲基轉移酶EZH2 mRNA，這是ES腫瘤生長和進展的關鍵介質。 通過qRT-PCR對細胞和外泌體中的RNA進行分析，結果顯示Col1-HA支架衍生的外泌體EZH2 mRNA水平高於2D培養，與患者血漿中觀察到的水準一致（圖4B）。 這些發現表明，Col1-HA模型產生的外泌體可作為潛在的ES生物標誌物，突出了其在EZH2 mRNA富集中的作用，並強化了在癌症研究中使用類似天然實驗模型的重要性。 儘管Western blot分析顯示Col1-HA TE腫瘤中EZH2蛋白增加，但在2D培養中未檢測到EZH2蛋白，未評估外泌體蛋白質組學貨物。
最后，研究结果揭示了Col1-HA在骨外分泌体中表达MSCs和EZH2 mRNA的能力。过去12年来，EZH2 mRNA已被添加到内化于骨外分泌体的hMSCs中，并随后用于内化于骨外分泌体的hMSCs。人破骨细胞（hOBs）和日本破骨细胞（hOCs）：然而，hOBs和hOCs在EZH2上呈现均匀且水平的形态。这种形态的精细性，Col1-HA支持的骨外分泌体中丰富的EZH2 mRNA，在不同类型的骨结构中不同的生物学效应，以及两种细胞培养方法的研究仍在进行中。
2.2.2 配位糖
脂肪糖是一种可从红藻中提取的天然多糖，具有可逆的热整合特性、优异的机械性能和低细胞毒性，被广泛接受用于生物医学应用。它能够提高细胞密度、蛋白质分布和糖产量，提供低粘度支持，促进细胞间相互作用，维持细胞的自然形态，并支持球形细胞的形成。其多孔结构使其能够获得高质量和高产量，且其产量不受化学处理的限制。然而，天然矿物糖的分布通常较为有限，且其在现有生物环境中存在诸多差异，例如凝固温度高、分解缓慢等，这些都限制了其操作或长期使用。我们测试了两种T175培养和微孔EV系统在人胃癌（hGC）细胞（MKN45和MKN74）中EV研究的实际应用。在为期两天的培养过程中，细胞产量达到60-70%，EV培养时间为48小时。在三年的培养过程中，我们首先在微孔中添加了微孔，然后进行了第一次培养，接着又进行了第二次EV培养，提高了培养基地的质量。不同的培养条件和不同的培养基地对EV的生长速度有不同的影响。
利用透射镜（TEM）和粒子追踪分析（NTA）测量外泌体（EV）深度，结果显示3D培养的EV尺寸为85-135nm，2D培养的EV尺寸为100-180nm。在原始包装分析中，3D培养每个细胞产生的EV数量为1020个（MKN45细胞），1656个（MKN74细胞），2D培养每个颗粒细胞产生的EV数量为636个。3D生物医学EV是教授开发的3D生物医学EV。本研究表明，3D培养的hGC细胞显示出更高的EV数量，同时，外分泌体也表现出独特的特征。
所需miRNA的特性各不相同，在培养过程中会收集特定的细胞外囊泡（EV）中间体RNA。在三种生物的EV中发现了164种miRNA，在两种生物的EV中发现了104种miRNA，其中10种miRNA是三种生物EV所特有的，4种miRNA是两种生物EV所特有的。目前，我们已分析了10种特有miRNA，并全面分析了EV的中间体行为，以及它们在疾病机制、炎症反应及其对生物过程的潜在影响。此外，我们还分析了这164种以EV为中心的miRNA的活性，结合p53、MAPK、TGF-β和RAS以及四个关键的癌症相关信号通路，探索了癌症相关机制。
采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了二维培养条件下细胞外囊泡（EV）的蛋白质质量。研究发现，EV来源（MKN45和MKN74）和培养条件（二维和三维）对蛋白质质量和含量有显著影响，且受Akira的影响，并存在大量不同的蛋白质含量。在二维和三维微培养的EV中，共检测到20种不同的蛋白质质量和含量，而在三维培养的EV中，有17种蛋白质质量和含量存在差异。本研究还对EV中ARF6信号通路的蛋白质特性及其膜相互作用和外分泌生物学机制进行了综合分析。
细胞外囊泡（EV）的变化及其机械效应和侵袭效应。常规的双细胞和三细胞培养的MKN45细胞与PKH26细胞一起培养30分钟，记录EV与MCF10A和MKN45细胞的相互作用。流式培养可在15分钟内完成，并增强相互作用。使用Matrigel基质质量模型EV培养室进行逐步侵袭，结合两种生物EV处理，增强三种生物EV的侵袭能力。
在脂质、糖和水汇聚的条件下，细胞外囊泡（EV）的数量均匀增加，miRNA的丰富度与癌症相关，并且ARF6通路蛋白出现。在当前条件下，EV似乎具有更强的侵袭能力，并构建了疾病模型以进行进一步的适应性研究。一项类似的研究对含糖微孔细胞（UC-MSCs）的中期EV产生特性进行了比较研究。然而，该研究报告尚未纳入EV本体，功能分析领域的基础结构也尚未得到扩展。鉴于蛋白质质量、质量和数量的相似性、人类意见的来源、EV丰度的三维演变以及蛋白质质量特征的方向和步骤依赖性，一项关于微孔微孔和外源细胞（EV）应用的研究报告已经发表，生长速率迅速增加，EV数量增加了近3倍，EV尺寸也增加了近3倍。在糖尿病大鼠模型中，球状体中 miRNA（如 miRNA-21-3p）和 EV 生物来源（如 CD82）的组合产生了更好的血管生成和相同的效果。
