本研究利用双螺旋线（LPDs）分析外分泌膜表面的脂质含量。研究考虑因素包括AH分泌差异、脂蛋白AI（ApoC）原始C端分泌以及LPDs管状表面差异。我们引入了ApoC与深层LPDs的竞争性组合，构建了合成的脂质质量外分泌体模型。结果表明，该模型环境敏感染料Nara Red（NR）具有较高的透射光增强效果和反应速率，并成功实现了LPDs的构建。由于其独特的力学特性，我们成功地在三种局部癌细胞（A549、Hela和MCF7细胞）中构建了外分泌LPDs。结果表明，深层外分泌膜LPDs及其周围膜具有独特的特征和特殊性质。这是一种独特的探索工具，也是一种强大的工具，能够帮助您深入了解外分泌膜。
[图1]
（A）双螺旋（AH）-孔（NR）双螺旋（AH）短光学探针（LPD）。（B）本研究中使用的ApoC-NR和p2-23-NR的研究结果。在HELIQUEST展览结束时。数量：南方。颜色：黄色，主要为高粘度残留物；灰色，少量低粘度残留物；蓝色，黑色残留物；粉状日本紫色，非电粘性残留物；绿色，黄色双液体酸。（C）Laurdan和DPH的化学结构。
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我们已完成多物种AH生物学研究，全面分析了ApoC和α-核蛋白p2-23，人工合成了NR和LPD，并探索了外分泌膜的进展（图1B）。先前的研究证实了高曲率横向膜蛋白在AH区域的重要性，这也与LPD的特定物理研究相吻合。基底深度是指LPD的定性立体定位“深度”或“深度”。含有HELIQUEST的ApoC α-螺旋结构，在p2-23期间表面比例增加（图1B），显示出清晰的基底结构。LPD组合。Asa层LPD日本p2-23组合效应。事实上，我们已经开发了一系列基于LPD的基础合成脂质物理分析方法。NR组合探针可用于LPD强度、平行光束直径探针波长和LPD外膜特性。由于其独特的特性，我们已成功研究了三种癌症和LPD的外分泌系统。完成了 AH-NR 研究，详细设计了新方法，为未来的外分泌膜分析工具奠定了基础。
[图2]
(A) 添加 20 μM AH（p2-23、ApoC 和 M2）后，DOPC 和脂肪酸 ΔGP 发生变化。 [劳丹]=0.5μM，[DOPC脂肪含量]=250μM。 (B) ApoC-NR 干度 DOPC 脂肪质量 p2-23/脂肪质量信息。 [ApoC-NR] = 2.0 μM，[DOPC 脂质] = 500 μM，[p2-23 肽] = 0–50 μM。检测波长为 552 nm。
首先，我們研究了兩個AH肽在結合合成脂質體時的插入深度，以使用標記有Laurdan的DOPC脂質體（平均直徑為115 nm）檢查其對LPDs的結合特性。 分子動力學類比及隨後使用Packmem演算法對LPDs的表徵表明，DOPC脂質體在膜表面同時具有深層和淺層LPDs。 Laurdan可以插入到脂質雙層中脂質尾部的深度，其發射光譜會因暴露在水中的程度而發生顯著變化，從而可以分析肽在膜上的插入情況。 圖2A顯示了AH肽結合后嵌入DOPC脂質體中Laurdan的ΔGP值變化。 ApoC結合導致Laurdan的ΔGP大幅增加，表明Laurdan暴露在水環境中的程度減少。 這意味著由於ApoC肽更深地插入膜中，膜的脂質堆積更加緊密。 相比之下，我們觀察到p2-23肽的ΔGP值下降。 這意味著在p2-23肽結合后，水更容易接觸到脂質體內的Laurdan，這很可能是由於p2-23肽較淺地插入膜中所致。 值得注意的是，觀察到的ApoC的ΔGP值與已知能深入插入膜中的M2肽相當。 結合其對LPDs的優先結合，這些結果表明ApoC和p2-23肽分別能夠識別高曲率膜上的深層和淺層LPDs。
我們接下來研究了這些肽是否會相互競爭結合DOPC脂質體。 如果ApoC和p2-23肽分別選擇性識別深層和淺層LPDs，則這些肽之間不會發生競爭結合。 在這裡，製備了通過C5連接子在N端結合NR單元的肽探針（ApoC-NR和p2-23-NR，圖1B）。 雖然這些NR探針在緩衝液中顯示出弱發射，但在加入DOPC脂質體后引起了發射增強以及發射峰的藍移。 這源於AH肽單元結合到膜表面LPDs上后，NR單元分配到膜區域。 通過螢光各向異性滴定實驗確定了表觀解離常數（Kd）。 ApoC-NR和p2-23-NR的Kd值分別為45 ± 14 μM和60 ± 12 μM（插圖，圖S3），顯示出這些探針具有相當的結合親和力。 在競爭結合實驗中，首先將p2-23肽與DOPC脂質體孵育形成p2-23/脂質體複合物，然後加入ApoC-NR探針。 在沒有p2-23肽的情況下，ApoC-NR在結合脂質體時顯示出強烈的發射，而在存在5-50 μM p2-23肽的情況下，其發射保持不變（圖2B）。 這表明ApoC-NR未被p2-23肽從脂質體上取代，說明ApoC肽不與p2-23肽競爭結合脂質體，因為它們的結合位點不同。 需要注意的是，我們在加入M2肽時觀察到ApoC-NR的發射顯著減少。 這歸因於ApoC和M2肽之間的競爭結合，因為這兩種肽都靶向深層LPDs，這也驗證了目前分析AH肽對LPDs結合偏好的實驗。 我們還發現在將p2-23-NR加入ApoC/脂質體複合物的情況下幾乎沒有競爭（圖S5）。 結合插入深度檢測結果（參見圖2A），ApoC肽可以作為深層LPD結合劑，而p2-23肽則優先識別淺層LPDs。
AH肽-NR探針對合成脂質體的螢光回應
我們接下來評估了ApoC-NR和p2-23-NR探針對合成DOPC脂質體或POPC（棕櫚醯-油醯-磷脂醯膽鹼）脂質體的螢光增強回應。 以下螢光實驗使用470 nm的激發波長進行，以便根據之前的文獻討論NR單元的溶劑變色回應以及探針的螢光增強回應。 脂質體脂質組成中不飽和醯基鏈的數量（DOPC中有兩個雙鍵，POPC中有一個雙鍵; 圖S1）極大地影響了LPD的豐度。 據報導，當DOPC被POPC取代時，深層和淺層LPDs都會減少。 隨著DOPC脂質體濃度的增加，探針的發射增強（圖3A），其中ApoC-NR對脂質體的螢光回應大於p2-23-NR。 ApoC-NR對DOPC脂質體的回應比對POPC脂質體的回應大4.8倍。 此外，p2-23-NR對DOPC脂質體的回應也比對POPC脂質體的大2.2倍。 這些結果歸因於由於醯基鏈中不飽和度增加而導致的目標LPDs數量增加，從而使探針更有利地結合到DOPC脂質體上。 因此，這些探針的螢光增強回應很可能反映膜上目標LPDs的豐度。
圖3
（A）添加DOPC或POPC脂質體后探針的螢
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光增強。 F和F0分別表示存在和不存在脂質體時在650 nm（ApoC-NR）或660 nm（p2-23-NR）處的螢光強度。 激發波長，470 nm。 （B）在不同膽固醇（Chol）含量（0-50%）的DOPC脂質體存在下，ApoC-NR的歸一化螢光光譜。 [ApoC-NR] = 2.0 μM，[脂質體] = 500 μM。 激發波長，470 nm。
我們隨後轉向探針中NR單元的溶劑變色特性，以評估它們是否能夠報告LPDs周圍的局部膜極性。 通過一系列溶劑中的光譜測量，證實了ApoC-NR和p2-23探針中的NR單元表現出強烈的溶劑變色特性，類似於NR本身（圖S6）。 在此，我們製備了不同膽固醇（Chol）含量（0-50%）的合成DOPC脂質體或POPC脂質體。 在使用我們的探針之前，根據文獻報導的方法，使用Laurdan的GP值估計了這些脂質體的膜極性。 DOPC脂質體的膜比POPC脂質體更具極性（更少有序），並且隨著Chol含量的增加，極性降低（圖S7），這與文獻報導的結果一致。 圖3B顯示了在存在DOPC/Chol脂質體的情況下，ApoC-NR的歸一化發射光譜。 ApoC-NR在DOPC脂質體中顯示出最大值（λem）為635 nm的強烈發射。 發現對於極性較低的POPC脂質體，λem值藍移到620 nm（圖S8）。 此外，隨著DOPC和POPC脂質體中Chol含量的增加，膜極性降低，觀察到逐漸的藍移（圖3B和S8）。 因此，結合其結合偏好，其發射很可能反映深層LPDs周圍的局部膜極性。 同樣，p2-23-NR在回應膜極性變化時表現出波長移動的發射（圖S9）。 p2-23-NR將報告淺層LPDs周圍膜極性的差異。
我们对局部膜特性进行了深入研究，同时对油的品质和数量循环进行了详细的直接分析，并收集了相关信息。随着NR辐射源的最新发展，我们分析了NR的部分短波长（ApoC-NR：590 nm和650 nm，p2-23-NR：590 nm和660 nm）。然而，微环境会随时间变化，短波范围内的辐射强度也会随时间变化。事实上，除了上述脂肪质量比、Laurdan测量方法、清晰一致性（GP比）之外，我们还将进行探索性高 相关性（4）均匀性声明，利用我们独立研究的能力，分析局部膜性能，并继续进行我们自己的研究。在接触过程中，对局部膜特性进行详细分析。在C1的接触过程中，NR原始片段的质量逐渐发生变化，发生熔融变化，NR原始片段的强度降低，此后变化程度最低（见S10）。因此，NR材料可在短短几小时内形成高效均匀的薄膜。在本研究中，我们使用了ApoC-NR和p2-23-NR，并探讨了组合C5的可能性。
图4
实际上，膜渗透性（GP）是存在的。
