背景
这种新疾病的主要病因是急性肺炎，但仍存在一些感染病例，其中大多数患者的免疫系统功能良好。然而，仍需保持警惕，因为人体内存在许多有害的有机化合物（VOCs），它们对人体具有多种毒性作用。不过，我也了解到，在某些情况下，有机化合物可能会长期存在。
结果
2022年10月，我们将报告SARS-CoV-2新感染患者（包括综合感染患者和长期感染患者）的基线分析结果。系统分析声明，自自登记以来的最新记录（2020年9月收集，附录B.1.1系列，2022年完成，基础分析完成）。自自登记以来，已获得超过89个积分。其中，1个积分变化，33个同源变化，以及蛋白质质量的定量变化。立即进展的轻微变化，综合变化17例，1例VOC小变化，1例VOC小变化，1例抗体逃逸确认，1例持续性疾病，1例持续性新感染；由于研究量少，缺乏一致性，发现1例“正常怀疑”。刺突蛋白：L452R、E484Q、K417T、Y453F，总N460K。分子化学分析，祖先变化率B.1.1 毒性诱导的比例增加。结果，平均dN/dS值增加了2.2，患者内部分析结果强烈支持这一结论。除此之外，原书的一小部分内容已被翻译成普通人，但其他人需要谨慎，其他人的体液突然发生变化，在一定时间内，其他人的生存能力下降，并出现少量疾病。
结论
我们的分析证实，SARS-CoV-2 存在于慢性感染患者体内，这是新疫情的主要来源，并揭示了其在长期感染期间的潜在影响。
引述
然而，SARS-CoV-2 的病例众多，且每种急性疾病通常都与之相关（2022；Stanevich 等，2023）。在当前的感染期，人群中感染病例的突然积累和疾病的突然传播难以察觉（Leung 等，2022；Quaranta 等，2022；Stanevich 等，2023）。在免疫系统较弱的情况下，免疫系统可能受到各种毒性化合物的影响，免疫系统可能逃避免疫系统的攻击，但也可能受到有毒细菌菌株（VOCs）的影响。s）长期教育成果（Rambaut 等，2020；Hill 等，2022；Viana 等，2022；Neverov 等，2023）。在长期感染患者中，机体会出现一些细微变化，包括病原体总量（VOI）和毒力菌株数量（VOC）的微小变化。这是一种“热点”——主要病原体的轻微变异；穿刺蛋白：L452R 和 E484K 就是一个突出的例子（Wilkinson 等，2022）。此外，在长期感染病例中，穿刺蛋白的穿透率增加，相似菌株的出现率增加，引入细菌的长期存活率增加（Ma 等，2022），以及持续感染效应（Du 等，2022）。
然而，SARS-CoV-2 并不影响呼吸道，但它也会影响许多其他器官（Van Cleemput 等，2021；Stein 等，2022）。本研究调查了早期免疫抑制患者的毒性演变，并研究了器官特异性变化，包括患者死后体内是否存在有毒有机化合物（VOCs）（Van Cleemput 等，2021）。值得注意的是，胃肠道疾病是新型冠状病毒疫情的一部分（CDC，2020）。通过这项研究，我们在一名患者体内发现了致病性 RNA 的致病机制（Stein 等，2022）。值得注意的是，胃肠道流速可能出现轻微变化（可能由于胃肠道流速的微小变化所致），这可能导致正常人呼吸道出现各种变化（Gregory et al., 2022）。本例中，胃肠道也出现轻微变化。此外，已有研究证实，少数患者的毒力存在于口咽部，但存在于胃肠道（Natarajan et al., 2022）。普遍认为，对于长期患有胃肠道疾病的患者，该疾病通常发生在急性呼吸道感染之后。
在此，我們描述了一名HIV陽性患者的病例，該患者在2022年10月被鑒定出具有高度分化的SARS-CoV-2基因型，這可能是極長期感染的結果。 有趣的是，該患者最初因胃腸道癥狀入院。 與這些癥狀一致的是，患者譜系特有的眾多突變中包括幾個在廢水測序中特有的突變，為病毒對胃腸道的適應提供了暗示性證據。 此外，患者的樣本包含許多與免疫逃逸相關和/或在VOCs中譜系定義的突變。 這些觀察結果共同為進一步支援VOCs可能起源於具有長期感染的免疫抑制患者的假設提供了依據，並且還表明胃腸道有時可能充當此類感染的儲存庫。
結果
病例描述
该女性患者于2022年9月因肠易激综合征症状（包括腹泻和肠鸣音）入院，地点为俄罗斯卡卢加市。她未接种过新冠疫苗。初始筛查检测显示，通过鼻咽拭子RT-PCR检测SARS-CoV-2阳性，通过抗原/抗体HIV检测HIV阳性。患者（以下简称”K患者”，代表”卡卢加”；此标识符仅限研究组内人员知晓，仅用于本出版物）自称自2005年起HIV阳性，从未接受过高效抗逆转录病毒治疗（HAART）。患者还伴有干咳和疲劳，但无发热。在住院期间，患者又接受了四次SARS-CoV-2 RT-PCR检测（入院后第3、6、9和13天），结果均为阳性。她女士催情藥 延時噴霧劑 性用品周邊 治療性冷感 淫蕩春藥水 男士催情藥 男士助勃藥 男士持久藥 補腎壯陽藥 迷昏失憶型 陰莖增大丸
近期无旅行史。
儘管診斷為新冠，但患者的X光影像未顯示肺部損傷跡象，也不需要氧支援。 然而，她的全血計數顯示白細胞減少（1.6%-2.2%）和低血紅蛋白水準（86-108 g/L）。 入院第14天，患者拒絕進一步治療並自行出院。
2023年4月，患者因腹瀉、肌痛、腸鳴音和進行性疲勞再次入院。
位於超長分支上的SARS-CoV-2樣本
我們對2022年10月2日（入院后第13天）採集的K患者的新冠樣本進行了測序，並將其存入全球流感數據共享倡議組織（GISAID），編號為hCoV-19/Russia/KLU-RII-MH107906S/2022。 生物資訊學分析強烈表明該樣本來自持續性感染。 具體而言，UShER工具將該樣本歸類為B.1.1譜系。 到2022年底，該譜系已近乎滅絕：除本報告的變異外，2022年9月1日後收集的GISAID序列中僅佔0.004%（549/12,648,328），且在當時俄羅斯收集的76,460個序列中僅佔0.06%（5/76,460）。 為驗證該樣本在B.1.1分支中的系統發育定位，我們考慮了其他工具：pangoLEARN和NextClade。 後者使用與UShER類似的方法，而前者採用完全不同的機器學習方法。 兩者均同意最可能的定位是B.1.1。
儘管該樣本在早期B.1.1分支中定位可靠，但其譜系高度分化，自與其最近共同祖先（LCA）分化以來獲得了89個點突變。 這個最近的鄰居hCoV-19/Russia/MOW-CSP-KOM-0303_S25/2020於2020年9月23日在俄羅斯莫斯科採集。 更廣泛地說，在14個系統發育鄰近樣本中，13個於2020年7月16日至2021年6月4日期間在俄羅斯獲得，確認該譜系可能起源於估計內部節點時間左右的社區感染。 根據貝葉斯估計，K患者分支的中位年齡為2.1年，90%最高後驗密度（HPD）為1.8至2.3年。 這將其祖先的日期定在2020年8月底，與最近外群序列的定年一致。 這些觀察結果強烈表明，這確實是一例持續性（長達2年或更久）SARS-CoV-2感染。 由於我們僅從K患者處獲得一個樣本，因此該譜系中一些獨特的突變可能發生在先前未測序的宿主中。 然而，考慮到長期迴圈的譜系會被採樣，一般人群中累積的突變可能構成了患者K譜系中突變的少數，甚至沒有。
長期感染：突變數量的最可能解釋
在沒有患者的時間序列樣本的情況下，我們通過首先證明它不可能是正常進化速率下一系列未檢測到的社區感染的結果，並且其次排除可能導致“長分支”觀察的另外兩種可能性（即污染和重組），來確定長期感染是所觀察到的高數量突變的最可能解釋。
患者K譜系中觀察到的89個突變與一系列社區感染不一致。 為證明這一點，我們使用BEAST估算了俄羅斯B.1.1譜系在患者K譜系之外的進化速率。 與其他估計一致（Hill等，2022;Markov等，2023），該速率為4.07×10^-4（95% HPD 3.32-4.83×10^-4）個核苷酸每年每核苷酸取代。 然而，如果患者K譜系也以該速率進化，這將意味著它在2022年採樣前7.36年就已從與其他B.1.1樣本的最近共同祖先分化。 該定年明顯與患者K譜系在2020年起源的B.1.1內的系統發育定位不一致（p < 0.0001），甚至與2019年SARS-CoV-2本身的起源不一致（Pagani等，2023）。 這種不一致性表明患者K譜系的主體一直在加速狀態下進化，意味著它不能對應一系列社區感染。 該譜系起源於慢性感染的假設進一步得到了其升高的取代率的支援。
我們通過觀察到該樣本沒有中間讀取頻率的變異體過剩來排除污染。 特別是，在樣本中觀察到的104個核苷酸點突變和插入缺失（即>0.5的讀取支援它們）中，只有少數具有中間讀取頻率：只有10個的讀取分數<0.8，其中只有2個的讀取分數<0.6。
為查看觀察到的序列是否可能是重組事件的結果，我們通過sc2rf運行它以查找CoVariants譜系之間重組的證據。 作為替代方法，我們使用了RIPPLES。 兩種方法均未檢測到任何重組事件。 不同VOCs和非VOC突變的“交錯”，以及在VOC定義突變位點處存在非VOC衍生等位基因，也與涉及系統發育距離較遠譜系的重組事件導致序列的假設相矛盾。
患者K樣本中升高的突變累積率
我們使用TempEst繪製了患者K樣本和包含它的UShER選擇子樹中序列自與武漢祖先序列分化以來累積的突變數量。 突變累積率在2022年初「急劇」上升，對應於Omicron變異株起源時不成比例的大量變化（Du等，2022;Ma等，2022）。 值得注意的是，患者K樣本（紅點）落在與同時獲得的“BA.2”樣本對應的Omicron雲的高端，儘管它屬於進化慢得多的B.1.1譜系。 因此，患者K樣本譜系中的突變累積率與Omicron分支起源時的速率相當。 值得注意的是，儘管速率相似，但累積突變的特性不同：患者K樣本與BA.2共用的突變很少。 患者K譜系進化的中位后驗速率為15×10^-4（90% HPD 12-18×10^-4）個核苷酸每年每核苷酸取代，是其他B.1.1樣本的3.7倍，再次證實該譜系起源於慢性感染。
單核苷酸取代是非同義的（83%），與在免疫功能受損患者樣本和VOCs祖先分支中觀察到的值相似（Harari等，2022）。 為評估患者K樣本的快速進化是否由正向選擇引起，我們應用了HyPhy中實施的分支-位點不受限制的表型多樣化統計測試（BUSTED）方法。 我們檢測到患者K樣本分支上整個串聯編碼序列（排除具有重疊讀碼框的核苷酸位置; 患者K樣本分支的dN/dS=2.2，而B.1.1樹的其餘部分為0.6，p=0.04）和刺突蛋白（dN/dS=5.7 vs. 0.7，p=0.0034）的正向選擇。 在患者K分支上觀察到的正向選擇（dN/dS > 1）與SARS-CoV-2全球進化中觀察到的主要負向選擇（dN/dS < 0.5）形成對比（Rochman等，2021）。 因此，患者K分支上突變累積率的增加可能是由該分支特有的正向選擇驅動的，主要作用於刺突蛋白中的突變。
刺突蛋白中的突變是長期感染、免疫逃逸和VOCs的典型特徵
在樣本的89個特有突變中，33個發生在刺突基因中，另有兩個框內缺失。 其中包括17個點突變，這些突變已在VOCs中或在VOCs中發現突變的位點中被看到，和/或在免疫功能受損患者中，和/或與免疫逃逸相關。 這些突變包括L452R、E484Q、K417T、N460K和Q498H。 除刺突蛋白外，該序列還具有幾個與超突變、慢性感染序列相關的ORF1a突變，最顯著的是T1638I（NSP3：T820I）和K1795Q（NSP3：K977Q）; 後者還在紐約市（NYC）廢水隱秘譜系中被識別，在其中一些譜系中其比例接近100%（Gregory等，2022）。 這些突變可能構成了病毒對宿主免疫系統選擇壓力的回應。
除點突變外，該樣本還在S基因中包含兩個缺失：Δ141-144和Δ210。 它們發生在McCarthy等（2021）命名法中NTD的四個反覆缺失區域（RDRs）中的兩個（RDR2和RDR3）中，並映射到不同的抗體表位（Wilkinson等，2022），與VOCs中的缺失重疊或相鄰：Alpha（Δ144）和Omicron/BA.1（Δ211）（Mittal等，2022）。
該表列出了在某些VOCs中譜系定義的突變，或在VOCs中譜系定義的位點上的突變，和/或顯示參與抗體逃逸的突變，和/或在其他持續性新冠感染病例中檢測到的突變，和/或是廢水樣本的特徵（見方法）。 對於後三組，表單元格列出了相應的參考文獻。
S基因中的其他突變包括H49R、H66Q、G72R、V126A、G181E、F186I、L216F、A222D、Y248H、Q271R、A372T、R765L、V772A、T1006I、A1078S和D1165E。
胃腸道與回歸？
患者K序列中刺突受體結合域（RBD）突變的模式與在廢水中檢測到的「隱秘譜系」中反覆發現的突變集合顯示出顯著重疊（Gregory等，2022），這些譜系被假設為具有胃腸道趨向性的長期慢性感染。 其中一些也在VOCs中被發現，例如K417T（Gamma）、K444T（BQ.1）和N460K（BA.2.75、BQ.1、XBB），而其他突變在廢水反覆出現但在GISAID中罕見。 一個例子是Spike：Q498H，它在GISAID中僅在96個序列中被發現（2022年12月22日訪問），但在Gregory等（2022）研究的9個下水道系統中的7個中被發現（同一位置的另一種取代Q498R存在於多個Omicron譜系中，因此廣泛傳播）。 這與患者表現出胃腸道癥狀的事實一致。 值得注意的是，在K患者感染前後，K444T、N460K和Q498H在GISAID中的頻率非常低（截至2022年3月15日分別為0.0023%、0.0026%和0.0006%），使它們在同一基因組中共存的可能性微乎其微，增加了這些突變構成胃腸道適應的可能性。
此外，Spike中密碼子828的雙突變（CTT→TTG）特別值得關注。 在假定的長期宿主體內進化過程中，序列可能經歷了中間狀態TTT（Spike：L828F），隨後是F828L回復突變為不同的亮氨酸密碼子。 L828F之所以引人注目，是因為它在廢水隱秘譜系中反覆出現，而在一般SARS-CoV-2序列（幾乎全部從呼吸道採樣）中極為罕見（Gregory等，2022）。 我們提出L828F可能代表在慢性感染期間對胃腸道的特定適應。 基於這一假設的事件鏈以及上述與廢水中反覆發現的其他突變的重疊，我們建議在感染的長期過程中，病毒在患者胃腸道記憶體在並適應了一段時間。 然而，最終，828L回復恢復了共識序列，可能更適合鼻咽部定位，病毒最終在鼻咽部被檢測到。 誠然，這一建議的機制高度推測性：828F變異本身未在患者K樣本中觀察到，雙突變CTT→TTG可能通過同義（L）CTG而不是非同義（F）TTT中間體進行，並且GI適應變異向鼻咽部定位的反向轉移途徑尚不清楚。 儘管如此，這一發現為進一步的間接證據增加了可能性，即某些慢性感染可能是胃腸道的（可能解釋隱秘廢水譜系）。 目前，由於這些譜系傳播證據不足，人們認為此類胃腸道慢性感染可能代表進化死胡同。 然而，在此序列中，我們發現該病毒已重新適應回呼吸道的初步證據，為這種病毒如何重新進化以通過空氣傳播提供了潛在機制。
與B.1祖先相比在細胞培養中生長受損
如有任何疑问，请参考下表：我有一例患者（HTB-37），其存活率处于中等水平。实验初期，我们设置了三种不同的TCID50/细胞密度（0.1、0.01和0.001 TCID50/细胞）和不同的培养温度（34℃和37℃）。不同毒株的毒力均一，具有温度依赖性和同质性，且KLU毒株的毒力与呼吸道感染部位不相容。我们设置了三种不同的pH值：中性pH=7.5、酸性pH=6.5和中性pH=8.5。病原体毒力有两种类型：pH依赖性同质性（中性或低pH）、长期对高pH敏感，以及KLU毒力因环境不同而变化。中国存在多种不同类型的病原体。当时，我们开发了一种B.1型毒株，而KLU毒株Caco-2模型细胞系统也具有较长的存活历史。早期对Omicron的观察显示出相似之处和差异，并且有多种系统可供选择。在早期阶段，SARS-CoV-2系统与Omicron的相互作用率相对较高，TMPRSS2对SARS-CoV-2系统的依赖性增加，病毒的毒力也随之增强（Meng et al., 2022; Willett et al., 2022）。我们目前使用的是Calu-3细胞，该细胞系存在时间较长，其TMPRSS2表面与Caco-2相似（Shuai et al., 2020）。然而，由于Caco-2 B.1毒株的出现，Calu-3各毒株的生长速率均有所增加；毒性菌株的劣势可能导致第二种可能性，这意味着某种疾病的毒液蛋白可能会发生变化，并且各个物种的抗旱性可能会有所不同（Mautner 等人，2022）。
审查
过去，VOC水平极低，慢性感染患者仍可在普通人群中持续感染（Rambaut et al., 2020; Hill et al., 2022; Viana et al., 2022）。这是HIV长期感染的一个例子。2022年，最有效的定位原则B.1.1，最有效的定位基地已关闭。自古以来，传染病的根除就是一个漫长的过程，某些毒性疾病也已被秘密清除。事实上，Omicron系统的起源速度与其起源速度相似。慢性感染期间VOC的支持作用：慢性感染期间VOC的相似性和矛盾性（Moulana et al., 2022）。
研究报告指出，人体内挥发性有机化合物（VOCs）含量正常，固定量较大，且存在特殊修饰和抗体逃逸的现象（在当前疫情形势下，人群中各种免疫功能均正常），但其对ACE2的抑制作用很小，且具有多种其他作用。本书内容存在一些不一致之处，但种类繁多，并对498种不同细菌菌株（如Q498H）的研究进展进行了完整描述。当加入Q498H时，GISAID的数量增加，文本也进行了添加，并在屏幕上进行了观察，N501Y在透明背景下进行了研究，其ACE2抑制作用增强。除此之外，Y453F 已变进为 BA.1 日本 BA.2，武汉虎 1 底色增强强度 ACE2，R403K 已变进为 BA.2，强力已达到 ACE2 的水平，但强度等级达到了报价方格。YOBA.1 和 BA.2 的步骤相同，但染色能力有所提高。Yuyu，本书包含与 BA.1 和 BA.2 相同的步骤，其染色能力高于理论可能值。
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限量版现场音乐。在目前情况下，未使用的致命注射剂已被证明极其有效。患者的免疫抑制状态（HIV感染）和家族史可能与之直接相关。
同一篇文章中明确指出，该新患者的感染史（新感染史）已达极限，感染根源在于当前治疗期的末期。在目前情况下，患者“出院”后，免疫系统无法逃脱，反而会攻击自身，但同时，免疫系统自身也具备产生免疫反应的能力。
因此，病原体在患者体内的寿命长短不一，寿命损失的比例也不均等，存在强烈的正向选择，尤其是在蛋白质特性本身就存在差异的情况下。潜江病原体的特殊攻击是一种突发性攻击，感染在出生前就已存在于体内。除此之外，这也是K型患者中最著名的特殊攻击之一。基于此观察，胃射精现象可以持续一段时间。这是一个高度互惠的概念，我们的pH依赖性是局部的。正因如此，我们尚未意识到免疫逃逸、长期感染、胃肠道症状以及有毒有机化合物（VOCs）的出现，导致对饮用水的突然需求。
