微环境对细胞间通讯和治疗具有显著影响。特别是对于侵袭性极强的癌症，例如母细胞囊肿肿瘤，放射治疗是一种有效的治疗方法。隧道管（TNT）是一种有效的通讯工具，可用于构建微膜隧道。这种通讯结构体积小，可以构建一个大型终端，并且适用于各种环境。在目前的研究中，我确定了TNT回路在U87 MG细胞中的作用，从而确定TNT的数量是否受到影响，以及未来可能对治疗效果产生的影响。除了TNT结构会受到皮肤运动蛋白和微管蛋白作用的定性影响外，膜结构的形成也取决于对TNT结构的了解。因此，我们完成了对U87 MG细胞中TNT细胞骨含量的分析，并完成了对其结构的研究。
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细胞色素B（CytoB）抑制蛋白质结合，从而影响TNT的形成。本研究发现，CytoB含量降低，TNT表达量增加，细胞蛋白活性增强，TNT网络变得至关重要。TNT含量与皮肤活性蛋白（TMZ）和AraC的含量相比，TNT网络的形成较为显著。由于TNT网络的存在，一些小型动脉瘤难以治疗，难以通过增加切除范围和加强切除来达到治疗效果。因此，目前母体动脉瘤治疗的不足之处在于，TNT控制的缺失是主要问题之一，也是未来研究发展的方向。
背景
隧道管（TNTs）是指直径小于100微米的微膜连接，连接点之间的距离很小。这种连接长度很短（小于100微米），是一种直接、快速的物质递送或有效沟通工具。最早的应用是在2004年，当时将大型小鼠导入PC12细胞肿瘤中。自问世以来，TNTs的应用范围已扩展到多种癌细胞、二维细胞培养以及正常细胞。研究表明，TNTs可以运输各种类型的物质，包括信号、死亡信号、细胞器官、病原体等。TNTs的研究表明，膜隧道可以与不同类型的细胞连接，并具有显著的形状和功能多样性。然而，由于其优异的快速交换性能，TNTs也具有良好的环境适应性，已被证实对癌症治疗具有重要意义。尤其是在多种癌症类型并存的情况下，不同组织间的相互作用与合作可能通过构建微环境而导致治疗失败。研究表明，TNTs可形成大规模的抗分子物质、促进抗药物质转运的物质、绿色颗粒、P-糖蛋白或miRNA。另一方面，有报道称稻米也可转化为TNTs，因此TNTs的转运系统也值得考虑。TNTs有望为癌症治疗提供新的途径，尤其适用于对新型治疗方法需求迫切的侵袭性癌症，例如母体囊肿。
胶质母细胞瘤是最常见和最恶性的脑肿瘤，中位存留期少于15个月。 这种癌症的侵袭性是由于其高度异质性、大基因组改变、对周围健康组织的高浸润率以及对治疗产生抵抗力的强能力所致。 胶质母细胞瘤的标准治疗首先是尽可能手术切除肿瘤组织，然后进行放疗和同时使用替莫唑胺（TMZ）进行化疗。 胶质母细胞瘤的特征是其浸润性生长模式进入周围健康脑组织，这使得完全手术切除具有挑战性。 在放疗过程中，健康组织区域内的浸润性肿瘤细胞可能接受亚最佳辐射剂量，使它们能够存活并继续生长。 因此，化疗代表了一种重要的补充治疗方式，有可能更全面地靶向分散的肿瘤细胞。 对于胶质母细胞瘤的化疗，通常使用烷化剂如TMZ。 然而，肿瘤经常在原发肿瘤附近复发，且对治疗的抵抗力增强。 单个细胞之间的相互作用，特别是TNTs实现的有效细胞通信，可能导致对治疗产生抵抗力的问题。
TNTs可能是理想的治療靶點這一假設在文獻中被廣泛討論。 然而，到目前為止，關於TNTs的知識非常有限。 它們在不同細胞類型中的巨大多樣性使得更難確定這些膜結構的關鍵點。 因此，它們與癌症的關係及其對新治療途徑的前景在很大程度上仍然未知。 為了更清楚地瞭解TNTs的作用，有必要了解通過TNTs的通信如何受到不同治療情況的影響，例如不同類型的輻射或使用不同的化療藥物。
本研究調查了化療藥物對U87 MG膠質母細胞瘤細胞系中通過TNTs的細胞通信的影響。 我們使用了膠質母細胞瘤治療中常用的藥物TMZ，並選擇阿糖胞苷（AraC）作為第二種化療藥物來分析其對通過TNTs的細胞通信的影響，原因有二。 首先，據報導，AraC在1 μM濃度下孵育24小時后可抑制白血病細胞中的TNTs，其次，AraC也在膠質母細胞瘤治療的背景下進行研究，因為這種化療藥物也能穿過血腦屏障。 兩種選擇的化療藥物都會破壞DNA複製。 TMZ導致DNA甲基化，而AraC充當錯誤的DNA構建塊。 我們還使用了細胞鬆弛素B（CytoB）來調查TNTs是否可以在U87 MG細胞中被抑制，並檢查肌動蛋白在TNTs中的作用。 CytoB是一種肌動蛋白聚合抑製劑，CytoB對TNT的抑制已在許多其他細胞系中得到證實，因此它的使用除了活細胞顯微鏡圖像外，還允許對TNTs中肌動蛋白的作用得出結論。 此外，我們對TNTs的細胞骨架進行了活細胞共聚焦顯微鏡檢查，以檢查微管蛋白和/或肌動蛋白是否存在於TNTs中。 我們更喜歡活細胞成像，因為細胞固定會導致許多TNT斷裂，從而扭曲TNT網路，如先前研究所示。
結果
TNTs的細胞骨架含量
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我們進行了活細胞顯微鏡檢查，以檢查U87 MG細胞中TNTs的細胞骨架含量。 為此，我們同時標記了細胞的質膜、微管蛋白和肌動蛋白，如方法部分所述。 在三個獨立實驗中，總共分析了85個TNTs的細胞骨架含量。
顯微鏡圖像顯示，肌動蛋白和微管蛋白信號並不總是在微小的TNTs中可見。 圖1（a）顯示了示例性共聚焦圖像，揭示了U87 MG細胞TNTs中肌動蛋白和微管蛋白的片段化存在。 肌動蛋白在（58±8;平均值±標準差）%的TNTs中可檢測到，而微管蛋白在（24±10）%的TNTs中可檢測到。 含有微管蛋白的TNTs數量顯著較少（雙樣本t檢驗（N=3）:P=0.01）。 分析顯示，所有含有微管蛋白的TNTs也含有肌動蛋白。 因此，（24±10）%的TNTs同時含有兩種細胞骨架成分，而（34±12）%的TNTs僅含有肌動蛋白。 TNTs中的細胞骨架含量與位於細胞內部的其餘細胞骨架相比要低得多; 因此，需要圖像處理如對比度增強，才能使TNTs中的細胞骨架含量可見。 TNTs中螢光的減少表明，與細胞內部相比，TNTs中細胞骨架成分的存在減少。 細胞骨架含量的信號強度在不同TNTs之間以及沿著TNTs的長度上有所變化。 在分析中，如果在TNTs的任何位置都能檢測到信號，則將TNT視為肌動蛋白或微管蛋白陽性。
CytoB對TNT網路的影響
在我們的研究中，我們分析了CytoB對U87 MG細胞TNT網路的影響。 我們使用CellMask™橙色質膜染色劑標記U87 MG細胞，然後將藥物以0.05 μM、0.5 μM和5 μM的濃度加入，並獲取共聚焦活細胞視頻。
CytoB導致TNT連接減少，因為連接細胞的數量以及每個細胞的連接數量隨著CytoB的加入而減少。 這種效應在CytoB濃度越高時越強。 該效應在1小時的最早時間點就存在，表明網路破壞的快速機制。 在最高濃度下，1小時后僅有（29±9）%的細胞連接，與對照樣品（58±16）%相比，顯著減少了兩倍（雙樣本t檢驗; P=0.0120)。 在對照樣品中，連接細胞的百分比增加到（74±10）%。 相比之下，在所有處理樣品中，網路無法恢復。 10小時后，與對照組相比，所有添加的CytoB濃度均顯示出顯著減少（雙樣本t檢驗; 0.05 μM: P=0.0396；0.5 μM: P=0.0015；5 μM: P<0.001)。
此外，我們還通過確定高度連接細胞的數量和複雜連接的比例來評估TNT網路的複雜性。 CytoB處理導致高度連接細胞數量顯著減少（雙樣本t檢驗; P=0.0061），在最早時間點（對照：（25±11）%，5 μM：（3±4）%）。 與對照相比，使用0.5 μM和5 μM處理的樣品無法增加高度連接細胞的數量。 0.05 μM樣品顯示出輕微恢復。 此外，兩種較高濃度在後期時間點傾向於抑制複雜連接。 可以得出結論，CytoB在濃度高達0.5 μM時降低了TNT網路的複雜性。 這種效應隨著CytoB濃度的升高而增強。 在最低濃度下，可以看到立即效應，該效應在後期時間點至少部分逆轉。
TMZ和AraC對TNT網路的影響
在證明某些藥物可以持續改變網路后，我們想知道某些化療藥物是否可能產生類似效果。 我們選擇了TMZ作為膠質母細胞瘤治療的標準護理藥物，以及AraC作為有前景的新藥物，該藥物已在其他癌細胞系中用於修改TNT網路。 使用TMZ濃度為1 μM、10 μM和100 μM，AraC濃度為0.1 μM、1 μM、10 μM和100 μM。
AraC和TMZ不影響U87 MG細胞中的TNT網路。 根據重複測量的雙向方差分析，無論是在連接細胞的數量還是在每個細胞的連接數量方面，均未觀察到顯著差異。 在成像開始時，連接細胞的比例在（40±12）%到（67.0±2.1）%之間變化，與化療處理無關，在AraC處理中變異性更高。 10小時后，所有測量條件下，這一比例增加到70%至83%。 在10小時時間點，連接細胞的比例已達到平臺期，在評估長達24小時的樣品中沒有可見變化（對照和AraC 100 μM）。 連接每個細胞的分析顯示了相同的趨勢。
此外，负责当前岗位的人员数量发生了变化，并且未来也会进行相应的调整。以 AraC 为例，3 小时内浓度为 10 μM，10 小时内浓度为 100 μM，可以看到两个峰值出现在成比例的时间段内。本书作者与前一本书的作者不同，P 值分别为 0.0418 和 0.0194。然而，对重细胞数量的双向差异分析表明，TMZ 或 AraC 处理之间的差异，以及连接或高连接细胞数量的比例差异是一致的。
审查
本研究的主要目的是检测体外培养的U87 MG细胞中TNT的含量。观察皮肤活性蛋白比例时，通常能观察到微管蛋白的比例，但仍存在一些中等和低丰度的TNT。虽然数量上没有疑问，但信号缺失，也没有规律可循。因此，TNT直径小、长度长，膜结构脆弱，细胞质量含量低。在本次研究中，我们测试了CytoB能否减少母细胞瘤细胞中的TNT数量，以及其他类型的培养基，并尝试在常规使用中抑制TNT。结果表明，U87 MG细胞不抑制母细胞瘤细胞中的TNT，且在治疗后1小时内即可抑制其出现，浓度为0.5 μM和5 μM时，改善程度较高，效果显著。因此，我们的研究结果与其他关于TNT的研究结果一致，膜的结构对于表达的皮肤活性蛋白来说非常重要。
细胞色素B诱导的TNTs抑制皮肤激活蛋白的结合，皮肤激活蛋白存在下TNTs的形成，以及TNTs结合机制调控过程中的重要作用，以及在各种不同细胞类型中正在进行的研究。然而，随着研究的深入，我们将进一步了解皮肤运动蛋白和其他囊性骨结构成分对细胞肿瘤TNTs的影响。探索各种微管蛋白的作用及其对母细胞动脉瘤的需求。
我们与CytoB公司合作，利用TNT抑制技术研究TNT的性能，这正是细胞结构如此坚固的原因。由于细胞形态的影响，毫无疑问，CytoB和微核技术抑制细胞分裂，不会导致细胞生长加速。正因如此，德国利用CytoB来加强信息传递，从而实现利用TNT进行通信。也正因如此，在TNT研究过程中，TNT抑制技术出现了不足。
除此之外，我们注意到TNT电路呈现出明显的自然波动。图3、4和5中的大误误（标误误）表达了部分测试结果的变化。我们的想象力集中于此，黑线是第11次独立测量的结果，而这种小规模的测量正是TNT网络中基本的波动运动。此处为直接参考，标准有所不同，其他测量均基于作者和作者的三维独立研究。因此，我们设计了一种具有自然高度变化的TNT网络。各种类型的自然变化都是可能的，并且可能产生较小的影响。正如您在此处看到的，CytoB对TNT网络的指导很小，因此很容易观察，因为可以测量此类TNT网络的数量。
本研究的第二个主要目标是探讨TNT回路对母体囊肿形成的影响。我们的结果展示了替莫唑胺（TMZ）和阿糖胞苷（AraC）在U87 MG TNT网络中的作用。TMZ是治疗母体囊肿的常用药物，而AraC目前也正在进行相关研究。除了克服血压紊乱外，TMZ和AraC也是治疗母体囊肿的主要标准。TMZ和AraC不仅破坏细胞DNA的修复，还会抑制DNA修复和细胞分裂。AraC常用于治疗急性髓系白血病（AML）。TNT目前也被用于AML的治疗，以促进AML治疗的进一步发展。研究表明，AraC可以减少AML细胞系统中的TNT数量。这是一个初步结果，AraC治疗AML还具有抑制细胞间物理通讯的作用，AraC治疗AML具有一定的应用前景。该研究结果表明，AraC 样作用抑制了 U87 MG 细胞中 TNT 通道的形成。
我们的研究结果表明，替莫唑胺（TMZ，目前治疗母体囊肿最常用的药物）对母体囊肿中的U87 MG TNTs没有影响。Valdebenito及其研究团队发现，TMZ能够形成大规模的膜接触。然而，其他分析基于这项研究，进一步减少了膜接触的数量，并使得在其他膜中捕获TNTs成为可能。管状结构的末端是这样的，目前尚不清楚膜是如何连接的（例如上皮细胞、微管或TNTs）。因此，我们能够获得有关TMZ通过微管或TNTs的膜隧道进行类似通讯的信息。这种治疗方法可能具有一定的耐受性。
请注意以下结果： 香港龙城大学图书馆所有产品； 香港龙城大学图书馆必购 产品；香港龙城大学编辑部；香港龙城大学图书馆；香港龙城大学图书馆；目前正在接受治疗，TMZ无法与TNTs沟通等是主要问题之一。然而，随着我们对沟通需求的不断发展，我们将继续研究TNTs，随着癌症疾病的不断发展，我们将能够展示沟通的实际效果。TNTs是在细胞彼此分离时形成的。此外，TNTs在转变之前一直存在。正因如此，TNTs的沟通方式与TNTs类似，这使得TNTs更具侵袭性。因此，对TNTs的积极研究需求依然存在。
此外，我们的报告展示了不同类型TNT的多样性。AML细胞中的TNT数量有所减少，但TNT对AraC U87 MG细胞的影响也已降低。由于我们已表达了对一种培养基中TNT的需求，因此我们对培养基中TNT在其他类型细胞中的应用也存在差异。AraC对U87 MG细胞中的TNT数量有限，这抑制了其分解的可能性。AML细胞中的TNT具有持续的横向生长形成能力，并且在母体囊性肿瘤细胞较少的情况下，它们会持续发生细胞运动形成。这是一个初步观察，AML中可能存在TNT形成的潜在机制，并且母体肿瘤的大小可能有所不同。
每个处理系统和照明系统的观察细胞数量差异显著。设施内的细胞数量会随时间增加（1小时后为40±11个细胞，24小时后达到62±17个细胞），因此工艺过程中的细胞数量保持不变，细胞毒性效应得以维持。这将导致细胞数量减少，并形成小规模群体。此外，我们不会使用任何材料，因为它们可能用于后续研发。因此，由于材料可用性或暴露时间不当，检测的有效性可能会受到限制。
当然，这项研究的范围有限。首先，仅使用单细胞系统不足以代表母体囊肿的特征。然而，这项研究的主要目的是了解TNT通讯的基本机制，但它与通讯系统并不直接相关。这项研究的进展取决于持续研究的需求，而这项研究的综合应用则反映了母体囊肿的负面特征以及患者病情的进展。
