症状性艰难梭菌感染（CDI）可导致显著的发病率和死亡率。 相反，患者可能在没有症状的情况下被产毒艰难梭菌定植，称为无症状定植。 我们先前证明，艰难梭菌毒素的存在和功能并不能区分儿童的无症状定植和CDI，表明其他因素的影响。 本研究旨在探究CDI儿童和无症状定植儿童粪便样本中的肠道微生物组和丁酸盐。
方法
设计：病例对照研究。 地点：三级护理儿童医院。 参与者和测量：无症状儿童通过核酸扩增检测（NAAT）检测艰难梭菌，若阳性则视为定植（n=50）。 还从症状性儿童（通过NAAT检测为艰难梭菌阳性）获取了剩余粪便样本（n=55）。 通过16S rRNA测序和液相色谱-质谱法评估微生物组和丁酸盐。
结果
与临床协变数和合并症相比，艰难梭菌症状状态（即无症状定植vs症状性CDI）对肠道微生物表现出最强的差异丰度关联。 症状性CDI与埃希氏菌/志贺氏菌（Escherichia/ Shigella，Benjamini-Hochberg调整q=3.94×10^-5）、嗜血杆菌（Haemophilus，q =0.022）和吉米杆菌（Gemella，q =0.085）的丰度增加相关， 而肠道共生菌如粪杆菌（Faecalibacterium，q =0.041）、布劳特氏菌（ Blautia ，q =0.041）和双歧杆菌（Bifidobacterium，q =0.063）的丰度减少。 我们还观察到症状性CDI参与者的微生物丁酸盐生产者和粪便丁酸盐丰度降低。
结论
无症状艰难梭菌定植和症状性CDI参与者的肠道微生物群和丁酸盐存在差异，表明它们可能在症状发展中起作用。
关键词：毒素，儿科，携带，代谢物
艰难梭菌是一种与显著发病率和死亡率相关的胃肠道病原体。 另一方面，由于机制尚不明确，艰难梭菌可以在不引起症状的情况下定植肠道，称为无症状定植。 无症状定植率最高的儿童包括癌症、炎症性肠病（IBD）和囊性纤维化（CF）患者，他们也面临其他原因导致腹泻的风险。 目前没有测试演算法能可靠区分症状性艰难梭菌感染（CDI）和因其他原因腹泻的无症状定植者。 尽管艰难梭菌毒素传统上用于诊断测试演算法，但我们先前的工作表明，在儿科伫列中它们无法区分症状性CDI和无症状定植。 此外，与无症状定植相关的相同艰难梭菌菌株和细菌负荷在其他患者中可能与严重疾病相关。 这突出了一个重要问题：如果艰难梭菌和毒素在无症状定植和症状性疾病患者之间相似，那么什么因素不同？ 这个问题对两方面很重要：（1）改进诊断测试和（2）了解影响艰难梭菌病理生理学的保护机制。
尽管发病机制与肠道微生物组密切相关，但关于儿科CDI患者与无症状定植者肠道
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微生物组和相关代谢物变化的已发表数据很少。 先前的研究受限于样本量小或仅在成人中进行。
利用一个特征明确的儿科患者伫列，我们比较了症状性CDI和无症状定植儿童的肠道微生物组和丁酸盐水准，以更好地理解这种重要细菌的病理生理学。
方法
研究设计
儿科参与者，年龄1至18岁，于2017年7月至2019年12月在范德比尔特大学摩纳哥·卡雷尔儿童医院前瞻性入组，获得家长知情同意和患者同意。 范德比尔特机构审查委员会批准了该研究。 数据使用REDCap资料库（REDCap软体，范德比尔特大学）保持保密。
无症状定植伫列
患有癌症、CF或IBD诊断的无症状儿童有资格入组。 要被视为无症状，参与者必须没有腹泻（Bristol粪便类型6或7），且未接受艰难梭菌检测或治疗。 获取粪便样本，取一份等分试样使用临床实验室的核酸扩增检测（NAAT）检测艰难梭菌。 如果NAAT阳性，儿童被视为定植。
症状性伫列
有腹泻（24小时内≥3次不成形大便且症状急性变化）并接受临床实验室检测且通过NAAT检测艰难梭菌阳性的症状性儿童入组。 这包括先前健康的儿童和其他合并症患者。 获得同意后，收集临床实验室的剩余粪便并储存在研究实验室。 入组方案比较见表1。
样本处理和临床检测
收集后冷藏粪便，分装后储存在-80°C。 对无症状和症状性参与者，使用Illumigene艰难梭菌检测（ARUP实验室）在医院临床实验室进行NAAT，这是一种检测编码毒素B的艰难梭菌基因tcdB的聚合酶链反应检测（灵敏度90%和特异性96%）。 在研究实验室通过酶联免疫检测使用Meridian Biosciences的Premier®毒素A和B重复测定毒素存在（灵敏度80.8%，特异性97.5%）。 通过Vero细胞圆化测定毒素功能，方法如前所述。
DNA提取和微生物组测序
如前所述，进行基因组DNA提取（Qiagen DNeasy PowerSoil试剂盒）、靶向PCR（16S rRNA基因V4区域）和配对末端测序（Illumina MiSeq 2×250 bp）。
16S rRNA数据处理
16S rRNA序列通过dada2流程（可在
微生物组分析的额外对照伫列
从健康对照儿童粪便样本中获取的16S rRNA测序数据先前已发表并可用于本研究（表1）。 健康对照也从摩纳哥·卡雷尔儿童医院招募，与无症状定植和CDI患者地理位置相同。
统计分析
大多数统计分析在开源R计算环境中进行。 Alpha和Beta多样性指标在ASV水准上使用R包vegan计算。 Alpha多样性指标的差异关联基于非参数Kruskal-Wallis检验。 使用99,999次置换的PERMANOVA评估Beta多样性（Bray-Curtis）的显著关联。 使用R包MaAsLin2中实现的微生物组多变数线性回归评估元数据与细菌分类群在门、属和ASV水准上的显著关联。 我们主要调整了包括年龄、性别、合并症和暴露史（抗生素、酸阻滞剂、住院和手术）在内的协变数，但进行了额外的敏感性分析，其中（1）我们按合并症组分层以确保关联一致，（2）我们调整了协变数的不同子集，包括未调整分析和仅调整年龄、性别和合并症的分析，再次确保发现一致。 使用Benjamini-Hochberg程式对不同微生物分类群的多重测试进行校正。 根据发现过滤掉存在于<5个样本中的微生物。
如果P值或q值（适当情况下）分别<0.05和<0.10，则认为关联显著。
液相色谱-质谱法测定丁酸盐
从粪便样本中提取的丁酸盐使用丹磺醯肼衍生化，然后使用靶向反相液相色谱-质谱法分析。 仪器和提取方法细节见补充方法。 定量基于丁酸盐丹磺醯化类似物的单反应监测检测：丁酸盐，m/z 336→171，CE 30;丁酸盐-d5 m/z 341→1
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70，CE 30。 数据分析使用Thermo-Finnigan Xcaliber进行，定量水准使用校准曲线确定。 样品通过内标（丁酸盐-d5）和粪便重量归一化，得到最终pmol/mg值。 使用GraphPad Prism通过Mann-Whitney U检验进行统计分析。
结果
研究人群
研究人群包括50名无症状艰难梭菌定植儿科参与者和55名症状性CDI参与者（表1）。 伫列的中位年龄为10岁（四分位距（IQR）5-15），55%为男性。 无症状定植伫列包括32名（64%）CF儿童、8名（16%）IBD儿童和10名（20%）癌症儿童。 比较无症状定植和症状性CDI患者（表2）。 症状性儿童年龄较大（中位数13[IQR 5-16] vs 9[IQR 4-12]岁，P=0.025），且根据入组策略具有不同的合并症谱（P<0.001）。 无症状定植儿童更可能在入组前30天内报告使用酸阻滞剂（76% vs 42%，P<0.001）。 伫列间的抗生素使用相似（54% vs 67%，P=0.23）。 C反应蛋白（CRP）值在症状性伫列中较高（中位数9.5[IQR 3.4-35.8] vs 2.6[IQR 0.2-7.4]，P=0.047），但其余实验室值无显著差异。
ELISA和Vero细胞圆化结果与症状状态不符
使用ELISA和Vero细胞圆化评估艰难梭菌毒素存在和功能。 该伫列的一部分先前已发表。 在症状性病例中，60.7%的样本艰难梭菌毒素A/B ELISA阳性，而无症状定植者为39.3%（P=0.32）（补充图1A）。 此外，53%的症状性患者Vero细胞圆化检测阳性，而无症状定植者为51%（P=0.88）（补充图1A）。 这些结果表明，基于毒素的测试无法区分症状性CDI和无症状定植儿科患者（以下简称艰难梭菌症状状态）。 无论症状状态如何，ELISA和Vero细胞圆化阳性均与艰难梭菌丰度增加相关（补充图1B和1C）。 丰富度和alpha多样性分析在ELISA和Vero细胞圆化阳性和阴性样本之间没有差异（补充图1D）。
