本研究探索了红松自身外分泌特性及其在改善皮肤疾病方面的应用，以及HaCaT细胞的疗效。结果表明，红松外分泌物可降低炎症因子IL-6的表达，增加Agen蛋白和清酸的生成，同时抑制MMP-1和Agen蛋白的活性。此外，本研究还探讨了日本紫玫瑰和胡椒等植物的外分泌作用。
抽象的
人体分泌物呈颗粒状，结构非常相似，能够渗透皮肤，被毛孔吸收并分解活性成分，并利用其他成分。HaCaT在预防疾病方面的有效性。事实上，MTS细胞活性已被证明能够改善因IL-6存在而引起的TNF-α/IFN-γ炎症反应中的皮肤疾病症状。此外，它还含有氰基蛋白、碱性金属蛋白酶（MMP）-1、透明碱性酸、氰基蛋白抑制活性、抑制蛋白抑制活性及其保护作用。研究结果表明，HaCaT细胞的外分泌活性、TNF-α/IFN-γ抑制IL-6的作用以及改善皮肤疾病的效果均未受到影响。此外，外分泌后，袁氏蛋白酸性表面增加，MMP-1水平下降，袁氏蛋白和酸性表面的作用受到抑制，袁氏蛋白对皮肤保护作用的抑制效果。本研究结果显示：赤松（Pinus densiflora）、花椒（ Zanthoxylum piperitum）和紫薇（Lagerstroemia indica）。
关键词：外分泌体；皮肤病；保护作用；胡椒（Zanthoxylum piperitum）；紫薇（Lagerstroemia indica）；赤松（Pinus densiflora）
1. 参考资料
皮肤是人体最大、功能最强大的器官，由表皮、真皮和皮下组织三层构成。皮肤具有多道褶皱，保护内部系统免受外部环境的影响[1,2]。表皮褶皱具有物理保护作用，防止水分流失，并在自然环境中维持皮肤结构[3,4]。最外层由富含脂肪酸、中等脂肪酸组成的角质层细胞构成，是抵御外界侵害的主要屏障[5,6]。真皮层紧密连接，位于皮肤的主要位置，形成外部褶皱，具有物理保护作用[7]，并能补充脂肪，保持皮肤水分，抵抗外部侵害[8,9,10,11,12]。当受到微生物侵害时，真皮层可能导致水分蒸发，增加微生物的易感性[13]。
异常或过度的免疫反应会导致皮肤正常功能受损[14]。慢性皮肤炎症会导致Th1和Th2细胞因子失衡。特别是Th2相关白细胞代谢产物（IL-4、IL-6和IL-13）水平升高，与皮肤疾病的恶化和持续炎症密切相关[15,16]。过量细胞因子（如TNF-α和IFN-γ）的产生会抑制角质形成细胞成熟，降低紧密连接细胞的表达，并影响正常的脂质代谢[17]。传统疗法，包括综合运用蕴含财富的神养疗法、维持疗法等，在修复皮肤疾病方面效果有限，需要快速维持皮肤状态，平衡需求，并调整平衡[18,19]。
近年來，細胞外囊泡（EVs），如外泌體，作為創新的生物活性載體，在組織再生和皮膚病治療中展現出前景，引起了關注[20]。 外泌體是微小的膜包被囊泡，通常大小為30–150 nm，由各種細胞類型分泌。 它們含有多種生物分子，包括蛋白質、脂質和核酸，在介導細胞間通訊中起關鍵作用[21,22]。 與人工納米顆粒相比，外泌體天然具有高生物相容性和結構穩定性，能夠在最小化免疫反應的同時有效遞送生物活性物質[23]。 植物來源的外泌體由於其天然來源和多樣的生物活性，最近在化妝品領域引起了越來越多的興趣[24]。 研究表明，植物來源的外泌體可以刺激膠原蛋白產生，減輕氧化損傷，並支持皮膚再生[25]。 這些囊泡為旨在抗衰老和增強皮膚屏障的產品中的合成成分提供了潛在的天然替代品[2台灣雄獅藥局官網 雄獅藥局線上訂購 雄獅藥局暢銷商品 關於雄獅藥局 雄獅藥局獨家資訊 雄獅藥局優惠券 雄獅藥局配送方式 雄獅藥局全部商品 台灣雄獅藥局必買產品 台灣雄獅藥局5折訂購
6]。 儘管越來越多的研究強調了它們的治療潛力，但植物來源外泌體在維持或修復表皮屏障方面的精確功能仍研究不足。
在本研究中，我們調查了從紅松（Pinus densiflora）葉子、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紫薇（Lagerstroemia indica）花朵中分離的外泌體提取物對人類角質形成細胞的保護和修復作用。 我們重點評估了它們調節細胞因數誘導的屏障破壞以及促進關鍵皮膚屏障和保濕相關生物標誌物表達的能力。 儘管對外泌體基化妝品材料的興趣日益增長，但關於植物來源外泌體的生物活性的資訊仍然有限，特別是從花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）獲得的外泌體。 在這項工作中，我們比較研究了從這三種植物來源提取的外泌體的皮膚屏障保護和保濕特性。 據我們所知，這是首次系統評估它們對人類角質形成細胞中表皮炎症、細胞外基質調節和水合相關通路的影響的研究。 這些發現有望為植物來源外泌體作為創新化妝品成分的潛在應用提供新的見解。
2. 材料與方法
2.1 外泌體的分離與純化
將紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）針葉分別在三蒸水中勻漿。 經過濾網過濾后，勻漿依次在4°C下離心（3500×g 15分鐘→15,000×g 30分鐘→23,000×g 45分鐘）以分離上清液。 收集的上清液通過0.45μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾。 濾液使用配備300 kDa膜的切向流過濾（TFF）系統（Minimate TFF膠囊300K OMEGA膜，Pall公司）濃縮和純化十倍。 濃縮液進一步通過0.2μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾，將每種植物來源的外泌體制備物按1：1：1比例混合進行後續實驗。 製備的外泌體樣品儲存在-80°C直至使用。
2.2 細胞培養
為評估外泌體的作用，我們使用了人角質形成細胞HaCaT細胞（Cell Line Service GmBH公司）。 細胞在含有10%胎牛血清（FBS）和青黴素-鏈黴素硫酸鹽（100單位/mL和100μg/mL）的杜爾貝科改良鷹培養基（DMEM）中培養，培養條件為37°C、5% CO₂環境。 細胞維持在培養密度低於1×10⁵個細胞/mL的條件下。
2.3 細胞毒性實驗
將處於指數生長期的HaCaT細胞以1×10⁵個細胞/孔接種在96孔培養板中，並用不同劑量的外泌體（1至1000μg/mL）處理24小時。 然後使用MTS試劑（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽）（Promega公司）評估細胞。 向每孔加入10μL MTS溶液，細胞額外培養4小時。 使用微孔板分光光度計（Multiskan Go，Thermo Scientific公司）測量490 nm處的光密度。 對照細胞被認為100%存活。 我們選擇了較低的外泌體實驗劑量。
2.4 ELISA生物標誌物分析
將HaCaT細胞以5×10⁵個細胞/mL的密度接種到6孔板中並培養。 更換含各種濃度測試樣品的新鮮培養基后，將細胞培養24小時。 收集的上清液用於評估皮膚保濕功效。 使用ELISA試劑盒（R&D Systems公司）定量炎症細胞因數IL-6。 使用ELISA試劑盒定量保濕活性的生物標誌物，包括I型前膠原（Abcam公司）、基質金屬蛋白酶（MMP）-1（Abcam公司）、透明質酸（R&D Systems公司）、膠原酶（Invitrogen公司）和彈性蛋白酶（Invitrogen公司）。
2.5 西部印跡分析
獲取培養細胞的全細胞裂解物，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，並進行西部印跡分析。 我們從Abcam公司購買了包括抗ASAH1、抗SHMT1、抗SPTLC1、抗包殼蛋白、抗PPAR-α、抗彈性蛋白和抗HAS-2在內的主要抗體。 抗絲聚蛋白（Thermo Fisher Scientific公司）、抗HAS-3（Santa Cruz公司）和抗p53、抗COL-1（Cell Signaling Technology公司）抗體分別從相應公司購買。
2.6 透射電子顯微鏡分析
使用透射電子顯微鏡（TEM; H-7600，日立公司）在80 kV加速電壓下檢查樣品的形態特徵。 對於TEM製備，將10μL顆粒懸浮液置於formvar/carbon塗層銅網上，吸附約1分鐘。 用濾紙去除多餘液體后，網格用2%（w/v）醋酸鈾負染30秒。 染色后的網格在室溫下完全乾燥，隨後在各種放大倍數下成像以評估顆粒大小和形態。
2.7 奈米顆粒追蹤分析
使用納米顆粒追蹤分析系統（NTA; ZetaView PMX-120，Particle Metrix公司）確定顆粒大小分佈和濃度。 測量前，每種樣品用三蒸水稀釋以獲得適當的顆粒濃度進行分析。 將稀釋后的懸浮液引入儀器，在相同的相機設置下，在11個預定義位置記錄視頻，進行三次連續掃描迴圈。 相機靈敏度設置為85，快門速度固定為100。 使用ZetaView軟體（版本8.05.16 SP7）處理所有記錄的視頻，計算平均顆粒大小、尺寸分佈和顆粒濃度。
2.8 LC-MS/MS脂質譜分析
對於脂質提取，將50μL PBS和50μL脂質標準溶液添加到沉澱樣品中，然後在冰浴中進行尖端超聲處理1分鐘（振幅10%，脈衝開啟：0.5秒，脈衝關閉：0.5秒）。 然後，加入250μL甲醇（MeOH）和1 mL甲基叔丁基醚（MTBE），使用旋轉器渦旋1小時。 加入200μL H₂O后，樣品再次在旋轉器上渦旋10分鐘。 通過在3000×g下離心5分鐘實現相分離，將上層轉移到新的Eppendorf管中。 為提取殘留脂質，向剩餘沉澱中加入400μL MTBE，渦旋10分鐘，再次在3000×g下離心5分鐘。 將所得上層與先前收集的上清液合併。 將合併的提取物在SpeedVac中完全乾燥過夜，並重新溶解在100μL MeOH：CHCl₃（9：1，v/v）中。 將每種樣品的4μL等分試樣注入UPLC系統的分析柱中。 使用溶劑B（有機相）的線性梯度在30分鐘內分離樣品，流速為0.25 mL/min。 每個樣品分析三次。 使用LipidSearch 4.2.21版進行脂質鑒定。 為確保準確的脂質譜，手動過濾結果中的假陽性峰。
2.9 統計分析
數據表示為均值±標準差（SD），所有統計分析均使用Sigmaplot v14.0軟體（Systat Software公司）進行。 通過單向方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較檢驗進行統計分析。 p值<0.05被認為具有顯著性。
3. 結果
3.1 透射電子顯微鏡和納米顆粒追蹤分析對植物來源外泌體的表徵
使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米顆粒追蹤分析（NTA）分析了從紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）葉子中提取的外泌體提取物的形態和物理特性。 如圖1所示，TEM圖像顯示分離的囊泡表現出典型的杯狀或球形形態，具有完整的脂質雙層膜，與外泌體已知的結構特徵一致。 未觀察到明顯的碎屑或聚集，表明分離和純化過程成功地產生了均勻的囊泡群體。 NTA測量進一步證實了外泌體制備物的納米級尺寸分佈。 顆粒濃度和分佈譜顯示所有三種植物來源之間具有高度一致性，表明外泌體穩定產生且在物理化學性質上具有可比性。 這些結果與TEM和NTA分析一起證實，從紅松、花椒和紫薇中提取的外泌體已成功分離和純化，表現出均勻的形態和納米級尺寸，從而為後續生物學和功能測定提供了特徵明確的囊泡。
3.2 外泌體提取物對人細胞系的毒性
首先，我們通過MTS實驗確定了外泌體對人角質形成細胞HaCaT細胞的潛在毒性。 本研究使用HaCaT角質形成細胞，因為它們作為一種廣泛使用的表皮細胞模型，保留了原代角質形成細胞的基本功能特徵，如分化潛力和對內外部及炎症線索的敏感性。 由於我們研究的重點是表皮屏障完整性和角質形成細胞驅動的炎症事件，該細胞系提供了合適的實驗系統。 相比之下，真皮成纖維細胞主要參與細胞外基質產生和真皮修復過程，因此更適用於以真皮重塑而非表皮生理為中心的研究。 儘管基於成纖維細胞的實驗可以補充我們的發現，但HaCaT細胞是解決本研究中檢查的表皮方面的最合適模型。 圖2所示的結果清楚地表明，外泌體提取物在處理的濃度範圍內未引起細胞毒性。
3.3 外泌體提取物對人細胞系中IL-6水準的抑製作用
為檢驗植物來源外泌體提取物的抗炎作用，在用TNF-α和IFN-γ（各10 ng/mL）刺激后，評估了HaCaT細胞中IL-6的分泌。 如圖3所示，與未處理的對照組相比，細胞因數刺激組的IL-6水平顯著增加，確認了炎症反應的成功誘導。 外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著降低了IL-6的分泌，表明這些囊泡能有效減輕角質形成細胞中細胞因數誘導的炎症。 在測試條件下，與水提取物處理組（ZLPW組）相比，外泌體處理組顯示出對IL-6表達的明顯更強的抑製作用。 這些發現表明，紅松、花椒和紫薇來源的外泌體通過調節促炎細胞因數的產生，發揮強大的抗炎活性，從而有助於在炎症壓力條件下維持皮膚屏障穩態。
3.4 外泌體提取物在人細胞系中的皮膚屏障增強功能
為進一步闡明植物來源外泌體提取物皮膚屏障增強作用的機制，通過西部印跡分析了TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT細胞中關鍵屏障相關蛋白的表達。 如圖4和圖S1所示，與未處理對照組相比，TNF-α/IFN-γ刺激顯著改變了幾種脂質代謝和神經醯胺合成相關酶的表達，包括ASAH1、SHMT1和SPTLC1。 外泌體提取物處理有效地逆轉了這些變化，顯著恢復了SHMT1和SPTLC1的表達，同時降低了在炎症條件下異常升高的ASAH1水準。 這些結果表明，外泌體提取物有助於正常化脂質代謝和神經醯胺生物合成，從而支持皮膚屏障恢復。 此外，我們檢查了結構和分化相關蛋白的表達，包括包殼蛋白、絲聚蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α），它們在維持表皮完整性方面發揮關鍵作用（圖5和圖S1）。 結果表明，TNF-α/IFN-γ刺激顯著降低了這些蛋白的表達，而外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著恢復了它們的水準。 與水提取物處理組（ZLPW）相比，外泌體處理的細胞顯示出這些屏障相關蛋白的更高上調。
綜合來看，這些結果表明，紅松、花椒和紫薇植物來源的外泌體提取物通過調節脂質代謝相關酶和對表皮分化和功能至關重要的結構蛋白，促進皮膚屏障修復。
3.5 外泌體提取物對MMP-1分泌和I型前膠原降解的抑製作用
I型前胶原是真皮生长纤维细胞中合成I型胶原的前体。为了研究植物外分泌体来源的细胞外物质对维持细胞外基质胶原代谢的影响，本研究使用了不同浓度的外分泌体（0.1、0.5和1μg/mL），并检测了HaCaT细胞中MMP-1的分泌和I型胶原的水平。如图6A所示，相比例较低，TNF-α/IFN-γ刺激下MMP-1分泌增加，且在炎症条件下观察到底物降解。由于外分泌体呈浓度依赖性分泌，MMP-1水平显著降低，细胞外基质发挥了保护作用。在下半部分，I型前胶原细胞表现强健（图6B）。在胶原水平升高之前，外分泌体促进了胶原合成，并可能改善了真皮基质的可塑性。此外，还研究了植物水分供应系统（ZLPW系统）的相对有效性、外分泌系统的有效性以及所暗示的外分泌系统更高的生物活性和运输效率。结果表明，源自红松、花椒和紫花植物的外分泌物质具有保护皮肤细胞和分解底物的能力，同时还能刺激胶原蛋白合成，并对皮肤具有抗衰老和延缓衰老的作用。
3.6 红松、日本胡椒和紫玫瑰植物外分泌排泄物对HaCaT细胞维持的影响
为了进行研究，我们使用了红松、花椒和紫草等植物来源的成分，这些成分具有人体内分泌、抗衰老、抑制机体降低外部基本质量的能力，并增强HaCaT细胞维持皮肤的能力。如图7所示，自体和生物来源的外分泌物质的特性相对比例受到原始蛋白（图7A）和活性蛋白（图7B）的抑制，且取决于浓度。这保护了体外细胞的质量，抑制了皮肤的入侵，并防止分泌物进入体内。此外，外分泌系统促进透明质酸（HA）的形成（见图7C），而透明质酸是维持皮肤水分的关键。因此，它抑制了外部分泌物进入体内，维持了刺激作用，并增强了皮肤的保水能力。此外，对西方印记的分析结果，比较了外分泌细胞物理类型I元蛋白（COL-1）、流体蛋白、纯酸合成关键因子2（HAS-2）和HAS-3的含量（Hitoshi发表，7D-G日文版S1）。此外，外分泌后，衰老关键调控因子p53的表达显著降低（图7F，图S1）。综合观察和研究开发，三种植物来源的外分泌物质增强了其能力，强化了其外在特性，合成并保护了皮肤，其效果是随着时间的推移，延缓和抑制衰老过程，抑制外部根本变化。
4. 复习
本研究表明，红松、花椒和紫椒具有多种外分泌特性和活性作用，这些特性使其功效日益增强。外分泌参数的结合可降低TNF-α/IFN-γ特异性炎症，促进表皮平衡，并表明蛋白质和脂肪的质量可作为关键因素。因此，子实体具有植物外分泌来源及其有机天然生物学效应，并具有类似的抗炎和再生作用。
在HaCaT细胞中，IL-6分泌减少，导致细胞因子依赖性炎症通路因外分泌特性而受到影响。因此，IL-6的产生是主要的炎症介质之一，它会导致细胞间紧密接触的细胞数量减少，进而造成细胞间破坏和损伤，最终在炎症条件下表皮生长略有增加。植物来源的免疫调节作用影响早期交叉生长阶段的细胞融合，植物来源的细胞外囊泡迅速到达MAPK和NF-κB信号通路进行调节，从而促进炎症并抑制细胞增殖。
ASAH1、SHMT1 和 SPTLC1 彼此相似，共同促进外分泌系统生长、角质层质量维持、角质层完全形成、脂质含量和高可塑性合成过程、综合包封蛋白、纤维蛋白、PPAR-α 表面发育、修复进程、表皮分化、脂质校正、破坏、形成和协调改善。我们共同宣布，增强外分泌系统，并支持抗炎条件的提供。此外，促进外分泌特性导致 I 型前透明酸性合成，同时抑制 MMP-1 和蛋白水解活性，增强外分泌特性并予以保护。因此，增强外分泌系统和真皮，防止外层细胞基础的退化并增强真皮。表 1 总结了 30 种脂肪中平均峰值质量最高的 ZPLE 产品，表 2 总结了主要脂肪类别。计算每件产品的平均MS1重量，计算每件产品的平均MS1重量，计算每件产品的平均MS1油重百分比。在现有库存产品中，PE和PI的比例最高。脂质品质促进起泡、细胞膜融合和皮肤状况。
如您所见，该产品独特地结合了三种植物来源的物质，其体外分泌物具有极高的功效。其中，富含红松的抗炎成分具有强效的抗炎特性；含有胡椒等抗炎生化化合物，也具有显著的抗炎作用。该产品是多种生物活性化合物的组合，它们能够协同作用，发挥生物活性，并充分发挥植物来源的体外分泌物比例优势，增强体外分泌物的抗炎活性，从而产生协同效应，提高抗炎效果。
如上所述，其结果是一种植物基、外分泌、对皮肤健康的合成米粒环境，具有生物相容性。同时，体内空气流动 ，液体增多，液体变稠，液体变厚 ，浓稠的液体变厚，粗茎变厚，粗茎变厚，粗茎变厚，浓稠的液体 变厚，浓稠的液体变厚，的液体变厚，粗茎变厚，浓稠的液体变厚，细茎变厚。男人的水，男人的外欲，水的昏沉，延长的液体，女人的泉水，女人的郊外，失忆型，欲望增加，MA，欲望，日常口交，滑液，印度神圣油信息，保护，增强，力量，力量，母乳和液体。
它能直接抑制炎症，平衡血脂，合成细胞外基质，并提供针对环境因素和衰老的全面保护。然而，越南消费者对该产品分子通路的精确性、体内消泡机制的证实以及其在体内分布的良好口碑都提出了更高的要求。
5. 总结
从花楸、躞薯和纺胺中进一步聚聚薯和纺胺中的设备对关键屏杏性的强效性。此外，外分泌物具有减少炎症、纠正TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT细胞、增强皮肤屏障功能的能力。这一点值得关注，因为它具有高效的活性，例如SHMT1和SPTLC1，并且需要横向调控包括包膜蛋白、纯蛋白、PPAR-α以及SHMT1和SPTLC1在内的蛋白质。此外，这种微小的特性刺激蛋白质的产生和透明的酸性合成特性，抑制MMP-1的表达，促进蛋白质的产生并抑制蛋白质的合成，对其发育具有显著的保护作用。换句话说，这种植物来源的外分泌成分强化皮肤，维持完美平衡，并增强皮肤的保湿能力。为了改善皮肤健康并保持水分平衡，我们开发了一系列重要且有效的保湿产品。
