eEF2K 是一种真核延伸因子-2，研究表明其在导管腺癌 (PDAC) 患者中表达升高，且与患者生存期缩短相关。本研究旨在探讨 eEF2K 的信息通路以及对 PDAC 肿瘤生长至关重要的肿瘤微环境 (TME) 的影响。内部实验表明，eEF2K 诱导的潜在因子显著受到抑制，导致两种小型 PDAC 小鼠模型中肿瘤生长适度，肿瘤相关巨细胞 (TAM) 减少，共存肿瘤组织中细胞死亡显著增加，且未观察到明显的毒性。研究发现，eEF2K 表达降低，AXL 受体活性增强，核质蛋白-1 (MCP1) 介导的 TAM 活性也增强，这些因素共同影响 PDAC 细胞介导的 Gas6/AXL 信号通路。此外，TCGA 数据库分析显示 eEF2K 存在于 TAM 的细胞中，并进一步提示其与患者短期生存相关。 TAM的释放会通过MCP1和Gas6影响PDAC细胞中eEF2K的表达以及AXL、SRC、VEGF、Snail和MMP2的活性，从而促进上皮-间质转化（EMT）、侵袭和血管生成。研究团队已证实eEF2K是PDAC肿瘤生长的关键驱动因素，并表明eEF2K是一种极具潜力的新型治疗策略。
【方法】
细胞培养条件
人腺癌细胞系（PANC-1 和 MiaPaCa-2）
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型`支持人急性肥大细胞白血病细胞系（THP-1）的开发，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。人腺星状细胞（PSCs）由Rosa Hwank博士（MD安德森癌症中心）提供。 PANC-1、MiaPaCa-2 和 PSC 细胞培养于添加 10% 胎牛血清 (FBS) 和 100 U/ml 青霉素-黑头 (P/S) 溶液的 DMEM/F12 培养基中。THP-1 细胞培养于添加 10% FBS 和 100 U/ml P/S 溶液的 RPMI-1640 培养基中。所有细胞均均匀接种于 37°C、5% CO₂ 的湿润环境中，并定期进行土壤接种。
siRNA染色
将PANC-1或MiaPaCa-2细胞以2.5 × 10⁵和3.5 × 10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中。孵育24小时后，使用Hiperfect染色试剂盒（Qiagen），在Opti-MEM低血清培养基（Life Technologies）中，分别加入50或100 nM浓度的siRNA或eEF2K siRNA（Sigma-Aldrich），进行中间染色，并按照商业协议进行操作。孵育6小时后，更换为含10% FBS的Opti-MEM培养基，继续孵育48小时。
过度使用慢性疾病毒性 eEF2K
為了實現eEF2K的穩定過表達，我們採用慢病毒質粒系統，將攜帶eEF2K編碼序列（NM_013302.3）的CMV啟動子（LPP-U0633-Lv105）或模擬載體（LPP-NEG-Lv103）感染PANC-1細胞。 初始步驟是將PANC-1細胞接種於96孔板（1 × 10^3個細胞/孔）並培養過夜以使細胞貼壁。 次日，將慢病毒顆粒稀釋在含5% FBS和1% P/S的細胞培養基中，補充終濃度為8 μg/ml的聚凝胺（EMD Millipore Corporation），並加入孔中。 48小時后，用含10 μg/ml嘌呤黴素的培養基篩選三周（Invitrogen/Life Technologies）。 過表達eEF2K通過Western blot分析確認。
單核細胞分化為巨噬細胞
將THP-1單核細胞接種於75 cm²培養瓶中，密度為每瓶2–2.5 × 10^6個細胞。 為誘導分化為成熟巨噬細胞（M0型），細胞用10 ng/ml佛波酯12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）處理24小時。 隨後，輕輕吸去含PMA的培養基，加入新鮮培養基（不含PMA）。 對於M2型巨噬細胞極化，加入終濃度為25 ng/ml的IL-4和IL-13，並繼續孵育24小時。 通過Western blot評估CD68、CD163和CD206的水準來確認極化狀態。
間接共培養實驗
將PANC-1、MiaPaCa-2和PSC細胞接種於6孔板中
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，密度為每孔3 × 10^5個細胞。 然後使用Corning公司生產的24 mm直徑、0.4 μm孔徑的Transwell插入系統與THP-1單核細胞或M1/M2巨噬細胞共培養48小時。 共培養結束後移除插入物，並對細胞進行進一步分析。
條件培養基收集
THP-1細胞在75 cm²培養瓶中培養並極化為巨噬細胞。 隨後將培養基替換為含1% FBS的培養基，繼續孵育24小時。 收集培養基，以1000 rpm離心5分鐘，經0.22 μm注射器過濾器過濾后立即使用。 PANC-1、MiaPaCa-2和PSC細胞用條件培養基與新鮮培養基按1：1比例混合處理48小時。
外泌體分離
THP-1細胞接種於75 cm²培養瓶中，每種細胞類型使用兩個培養瓶（THP-1細胞、M0巨噬細胞和M2巨噬細胞; 總計六個培養瓶）。 細胞按照前述方法進行分化，並將培養基替換為含10%去外泌體FBS（System Biosciences）的RPMI-1640培養基。 在去外泌體培養基中孵育24小時后，收集上清液，以+4°C、1000 x g離心5分鐘去除細胞碎片，再以+4°C、2000 x g離心30分鐘。 使用Beckman Coulter公司的超速離心機，將上清液以+4°C、60,000 x g離心45分鐘，然後以240,000 x g離心90分鐘。 外泌體沉澱用濾過磷酸鹽緩衝液（PBS）重懸，使用NanoSight（Malvern）定量后立即使用。
MCP-1分泌水平測定
在PANC-1細胞與THP-1細胞/巨噬細胞間接共培養48小時后，從6孔板的每個孔中收集培養基。 還收集單獨培養的THP-1細胞、M0和M2巨噬細胞以及PANC-1細胞的培養基作為對照。 根據人特異性MCP-1 ELISA試劑盒（R&D Systems）的說明測量MCP-1濃度。
重組MCP-1和Gas6處理
重組人MCP-1/CCL2蛋白（R&D Systems）溶解於無菌PBS（含0.1%牛血清白蛋白）中，濃度為100 μg/ml作為儲存液。 重組人Gas6蛋白（R&D Systems）溶解於無菌水中，儲存濃度為500 μg/ml。 將PANC-1細胞接種於6孔板中，密度為每孔1.5 × 10^5個細胞，並孵育過夜使其附著。 對於Gas6處理，將培養基替換為無FBS的培養基並孵育過夜。 隨後，用不同濃度的Gas6（200、400、600 ng/ml）處理30分鐘。 對於MCP-1處理，細胞在無FBS培養基中暴露於不同濃度的MCP-1（10、25、50 ng/ml）24小時。 隨後，按照上述方法刺激細胞，並用於進一步實驗。
增殖和集落形成實驗
通過克隆形成實驗評估PANC-1細胞的集落形成能力。 將PANC-1細胞接種於6孔板中，每孔5 × 10^2個細胞。 培養過夜后，細胞用外泌體（1.5 × 10^8個外泌體/孔）或siRNA（對照和eEF2K，25 nM）處理24小時。 隨後替換為新鮮培養基，連續培養10–14天直至可見集落形成。 用結晶紫（0.5% w/v）染色集落，並使用ImageJ軟體（National Institutes of Health）計數。
細胞運動/遷移實驗
使用劃痕癒合實驗測量細胞遷移能力。 將PANC-1細胞接種於6孔板中，密度為每孔3 × 10^5個細胞，培養24小時。 使用200 μl無菌移液槍頭製造劃痕，並用培養基輕輕洗滌去除細胞碎片。 然後用外泌體（1.5 × 10^8）、siRNA（對照和eEF2K，50 nM）或與單核細胞/巨噬細胞共培養48小時。 劃痕后立即使用倒置顯微鏡（Nikon Eclipse TE-200-U）拍攝圖像以測量0小時的劃痕寬度。 在劃痕後24小時和48小時再次拍攝照片。 每孔至少捕獲三個隨機非重疊圖像。
細胞侵襲實驗
將PANC-1細胞接種於6孔板中，並施加與先前描述相同的處理（外泌體、siRNA或共培養）。 24小時后，收集細胞，用無血清培養基洗滌，並重新懸浮於200 μl無血清培養基（5 × 10^4個細胞）中，加入塗有Matrigel基底膜（0.7 mg/mL; BD Biosciences）的24孔板Transwell插入物（8-μm孔徑; Fisher Scientific）。 下腔填充含10% FBS的500 μl培養基作為化學引誘劑。 24小時后，固定侵入細胞，用Hema 3染色試劑盒（Thermo Scientific）染色，並用棉簽擦去上腔細胞。 隨後拍照並使用ImageJ軟體統計侵入到濾膜下側的細胞數量，結果表示為三次重複測量的平均細胞數。
Western blot分析
经上述处理后，用冰冷的PBS洗涤细胞，然后在含有蛋白质和酸的1×RIPA裂解缓冲液（Thermo Scientific）中于4℃裂解30分钟。裂解液在4℃、13,000×g离心力下离心10分钟，收集上清液。使用Pierce BCA蛋白定量试剂盒（Thermo-Fisher Scientific）测定蛋白浓度。之后，将裂解液重悬于Laemmli缓冲液（Bio-Rad）中，并在95℃加热5分钟。取等量蛋白（每次30–40 μg）进行SDS-PAGE电泳，电泳产物经PVDF膜分离。用于膜的TBS-T缓冲液（含5%脂肪的牛肉）密封，标准单电阻探针包括：eEF2K、p-eEF2 (Thr56)、Src、p-Src (Tyr416)、MMP-2、Snail、CCR2（Cell Signaling Technology）、CD68、CD163、CD206（Abcam）、MCP-1、Axl、p-Axl (Tyr702)（R&D Systems）、Gas6（Abcam）。使用后，请标记其为抗兔、抗鼠或抗山羊（Cell Signaling Technology）。HyGLO化学发光HRP电阻测试（Denville Scientific）。每次将胶条（Kodak）在暗室中曝光0.5-10分钟。连续测试后，使用Restore™ PLUS Western Blot解离缓冲液（Thermo Scientific）处理膜15分钟。 β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）用于替代GAPDH（Cell Signaling Technology）。
