細胞外囊泡（EVs）由所有類型的細胞釋放到細胞外環境中。 其中一部分稱為外泌體的EVs大小在30至200納米之間，由於其作為細胞間通訊載體的功能而具有生化興趣。 它們能夠運輸蛋白質和遺傳物質，使其成為基因治療中理想的載體。 在生物治療領域，牛乳源性細胞外囊泡（MDEVs）因其作為替代其他外泌體來源用於治療傳遞的潛力而備受關注。 牛乳因其複雜的膠體基質而帶來獨特的挑戰，這種基質主要由脂肪和像酪蛋白這樣的蛋白質組成，形成表現出類似外泌體特性的微粒，特別是大小和密度。 面對像牛奶這樣複雜的基質，傳統的基於大小/密度的分離方法，包括超速離心和尺寸排阻色譜法，在實際時間和成本範圍內難以提供高純度的產量。 當與逐步疏水作用層析（HIC）梯度結合時，聚酯（PET）毛細管通道聚合物（C-CP）纖維在柱和旋下尖端格式中已被有效用於從多種來源分離外泌體。 本文展示了PET C-CP纖維柱從預處理的生牛奶中分離MDEVs的能力，在不到20分鐘的時間內產生1.5 × 10^10顆粒/mL的濃度，純度約為~2 × 10^10 EVs/μg蛋白質。 分離過程的有效性通過一系列表徵方法進行了驗證。 使用PET C-CP纖維柱進行MDEV分離解決了傳統分離方法所面臨的問題，有望擴大規模應用於治療。
圖1 描述了最終牛乳樣品處理流程，以進行C-CP纖維程式。 將100 μL上清液注入安裝在Ultimate 3000 HPLC上的聚酯C-CP纖維柱中進行分離。
圖2 通過PET C-CP纖維柱從原始過濾脫脂牛奶中分離乳源性外泌體的HIC色譜圖。 注射體積 = 20 μL。 梯度步驟開始后約3分鐘出現物種洗脫，反映了流體/柱的傳輸時間。
圖3 通過PET C-CP纖維柱從1：1稀釋的原始過濾脫脂牛奶中分離乳源性外泌體的HIC色譜圖。 注射體積 = 100 μL。 梯度步驟開始后約3分鐘出現物種洗脫，反映了柱的傳輸時間。
圖4 代表性的HIC色譜圖，顯示1：1 PBS稀釋的原始過濾脫脂牛奶在注射前用不同濃度（1%-6%）的乙酸處理。 注射體積 = 100 μL。
圖5 1：1 PBS稀釋的原始過濾脫脂牛奶
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圖6 透射電子顯微鏡圖像：a） 酸沉澱前稀釋的原始牛奶（500 nm尺規），b） 酸沉澱后稀釋的原始牛奶（2 μm尺規），c） 分離的EVs展示預期的大小範圍（30-200 nm）（200 nm標尺），d） 單個EV隔離后清晰顯示完整的脂質雙層和杯狀形狀（500 nm標尺）。
圖7 通過NanoFCM Nanoanalyzer測量的光散射數據的粒子大小分佈直方圖，顯示n = 3次試驗的中位結果。 校準數據顯示粒子密度為2.71 × 10^8 particles/mL，平均粒子直徑為68.8 nm，模式為53.8 nm。
圖8 代表性的NanoFCM生成的完整過程分離物螢光響應點圖。 a） 測量空白，未進行標記。 b） 基於抗CD81-FITC Ab標記鑒定MDEVs。 c） 使用MEMGlow™和抗CD81-FITC Ab雙重標記進行全面鑒定。
圖9 通過Bradford測定法測得的原始牛奶、6% Ac預處理牛奶注射、蛋白質和EV組分的總蛋白質含量（μg/mL）。 RIPA裂解的EV分離物的micro-BCA測定結果也顯示在500 ng載入的EV裂解物和純β-酪蛋白的代表性SDS-PAGE/免疫印跡圖像中。 兩種蛋白質測定均使用β-酪蛋白作為標準曲線。
